L’athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique des artères de gros et moyen calibre provoquée par l’infiltration et l’accumulation progressives de lipoprotéines de basse densité (LDL cholestérol) dans l’espace sous-endothélial [ 1 ]. Les lipides, une fois oxydés au contact de la matrice extracellulaire, induisent l’activation de l’endothélium et le recrutement local des leucocytes circulants, et plus particulièrement des monocytes [ 2 ]. Ces monocytes se différencient, dans l’ intima de la paroi artérielle 1 , en macrophages, qui expriment des récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires comme les récepteurs de type Toll-like (TLR), la dectine 1, ou les récepteurs « éboueurs » ( scavengers ) tels que la molécule CD36, et sont ainsi capables de reconnaître les LDL oxydées et de phagocyter les cellules apoptotiques [ 3 ]. La reconnaissance des LDL oxydées dans la paroi vasculaire par la molécule CD36 et leur internalisation par les macrophages entraînent l’activation de voies de signalisation pro-inflammatoires et la transformation de ces macrophages en cellules spumeuses, chargées en gouttelettes lipidiques [ 4 ]. Une surcharge lipidique trop importante peut déclencher la mort cellulaire programmée (apoptose). Lorsque l’élimination des cellules apoptotiques n’est pas optimale, les débris cellulaires et les cristaux de cholestérol s’accumulent et s’organisent en un noyau nécrotique, qui favorise la progression et les complications de l’athérosclérose [ 5 ]. Cependant, les mécanismes moléculaires impliqués dans l’activation des macrophages et leur transformation en cellules spumeuses sont encore imparfaitement compris.
Dans cette étude, nous nous sommes intéressés au rôle de la protéine CARD9 ( caspase recruitment-domain-containing protein 9 ) dans le développement de l’athérosclérose chez la souris. CARD9 est une protéine adaptatrice, présente dans les macrophages et les cellules dendritiques, qui permet l’intégration des signaux en aval des récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires, et qui joue un rôle critique dans la modulation des réactions inflammatoires. CARD9 est impliquée dans la production de cytokines et dans la polarisation des lymphocytes T de type Th17 [ 6 ]. Le rôle de CARD9 dans la modulation de la réponse immunitaire diffère selon le contexte et le modèle expérimental, et deux études ont précédemment rapporté des résultats contradictoires quant au rôle de CARD9 dans le développement de l’athérosclérose [ 7 , 8 ].
Nous avons d’abord étudié l’expression de CARD9 par les cellules immunitaires présentes dans les plaques d’athérome de souris par analyse transcriptomique et par immunofluorescence. Ces analyses ont révélé que CARD9 est présente dans les macrophages de l’ intima à des stades précoces et tardifs du développement de la maladie vasculaire [ 9 ]. Afin d’évaluer le rôle de CARD9 dans le développement de l’athérosclérose, nous avons utilisé un modèle de souris sensibles à l’athérosclérose et génétiquement déficientes pour CARD9 (souris Apoe -/- Card9 -/- ). Après six semaines de régime alimentaire riche en cholestérol, ces souris développent des lésions d’athérosclérose plus importantes que les souris témoins ( Apoe -/- Card9 +/+ ), avec une augmentation du contenu des plaques athéromateuses en macrophages et un noyau nécrotique plus volumineux [ 9 ]. CARD9 étant un puissant modulateur de la production de cytokines et de la polarisation des lymphocytes T, nous avons ensuite stimulé in vitro des cellules de la rate des souris Apoe -/- Card9 -/- et Apoe -/- Card9 +/+ pour évaluer l’impact de la déficience en CARD9 sur la réponse inflammatoire globale. Les cellules de la rate déficientes en CARD9 produisent moins de TNF-α ( tumor necrosis factor α) que les souris témoins, sans différence de production d’interleukine-10 et d’interleukine-1β [ 9 ]. Afin d’étudier spécifiquement le rôle de CARD9 d’origine hématopoïétique, nous avons transplanté de la moelle osseuse provenant de souris Card9 -/- ou Card9 +/+ chez des souris Ldlr -/- préalablement irradiées pour détruire leurs cellules hématopoïétiques, et les souris receveuses ont ensuite été soumises à un régime riche en cholestérol pendant huit semaines. À l’issue de cette période, malgré des taux de cholestérol plasmatique similaires, les souris chimères Ldlr -/- Card9 -/- ont développé des plaques d’athérome plus volumineuses et plus inflammatoires que les souris chimères Ldlr -/- Card9 +/+ témoins, avec plus de macrophages dans les plaques et un corps nécrotique plus volumineux. Dans ce modèle, les cellules de rate des souris chimères Ldlr -/- Card9 -/- stimulées in vitro produisent moins de TNF-α, mais également moins d’interleukine-10 et d’interleukine-1β que les cellules de la rate des souris témoins [ 9 ]. Étant donné l’implication de CARD9 dans la polarisation lymphocytaire T, nous avons ensuite généré des souris Apoe -/- Rag2 -/- Card9 -/- , dépourvues de lymphocytes T, B, et de cellules natural killer (NK), et soumis ces souris à un régime riche en cholestérol pendant six semaines. Comme précédemment, la déficience en CARD9 dans ce modèle est associée à une aggravation des lésions athéromateuses [ 9 ], ce qui suggère que la réponse immunitaire adaptative n’est pas impliquée dans l’accélération de l’athérosclérose observée chez les souris déficientes en CARD9.
Le phénotype lésionnel des souris déficientes en CARD9 est caractérisé par une augmentation de la taille du noyau nécrotique de la plaque athéromateuse. Dans la mesure où la formation du noyau nécrotique est liée à l’accumulation intracellulaire de lipides, nous avons ensuite évalué la capacité des macrophages Apoe -/- Card9 -/- à internaliser les lipides oxydés in vitro . L’absence de CARD9 entraîne une augmentation de l’endocytose lipidique et du nombre de cellules spumeuses après stimulation par les LDL oxydées. L’analyse transcriptomique et par immunofluorescence des macrophages Apoe -/- Card9 -/- exposés aux LDL oxydées a révélé une augmentation significative de l’expression de CD36. La déficience en CARD9 induit une modification phénotypique des macrophages vers un profil plus inflammatoire, avec une production accrue d’interleukine-1β et une moindre production d’interleukine-10 après stimulation in vitro . De plus, les macrophages Apoe -/- Card9 -/- sont plus enclins à l’apoptose que les macrophages témoins Apoe -/- Card9 +/+ après exposition aux LDL oxydées (ox-LDL) in vitro , et également in vivo dans les plaques d’athérome [ 9 ]. Pour tenter de comprendre cette susceptibilité accrue des macrophages à la mort cellulaire en l’absence de CARD9, nous nous sommes intéressés au rôle potentiel de l’autophagie, un mécanisme intracellulaire de dégradation et de recyclage de composés cellulaires impliquant les lysosomes, qui peut être sollicité physiologiquement ou utilisé par les cellules comme un mécanisme compensateur en cas de stress métabolique. Un défaut d’autophagie peut entraîner l’accumulation de matériel endommagé dans le cytoplasme et provoquer un stress cellulaire pro-apoptotique. La machinerie d’autophagie est une machinerie dynamique complexe, dont le dysfonctionnement s’accompagne d’une accumulation intracellulaire de la protéine p62. CD36, qui est surexprimé chez les souris déficientes pour CARD9, a précédemment été impliqué dans la régulation de l’autophagie via une cascade de signalisation dépendante de la protéine AMPK ( AMP-activated protein kinase ) [ 10 ]. Afin d’évaluer l’implication du flux autophagique dans l’effet pro-athérogène de la déficience en CARD9, nous avons utilisé différentes approches expérimentales in vitro et in vivo . En culture cellulaire, nous avons mis en évidence une diminution de la phosphorylation de AMPK associée à une accumulation intracellulaire de p62 dans les macrophages Apoe -/- Card9 -/- , une accumulation majorée par une exposition des cellules aux LDL oxydées. In vivo , les plaques d’athérome contiennent plus de macrophages MOMA + ( anti-macrophage/monocyte monoclonal antibody ) p62 + chez les souris Apoe -/- Card9 -/- que chez les souris témoins. De plus, deux traitements pharmacologiques activateurs du flux autophagique (metformine et rapamycine) ont permis d’abolir l’accumulation intracellulaire de p62 et de corriger l’accélération de l’athérosclérose chez les souris déficientes en CARD9. La surexpression du récepteur CD36 induite par la déficience en CARD9 constitue un mécanisme clé pour l’effet pro-athérogène de cette déficience, car cet effet disparaît en l’absence de CD36 : les phénotypes vasculaire et inflammatoire des souris Ldlr -/- Cd36 -/- Card9 -/- et Ldlr -/- Cd36 -/- Card9 +/+ sont en effet similaires [ 9 ]. Enfin, pour évaluer la pertinence médicale de ces résultats expérimentaux, nous avons analysé des monocytes humains de patients ayant une mutation « perte de fonction » de CARD9 , et avons confirmé que la déficience en CARD9 affecte la production de cytokines pro-inflammatoires, la susceptibilité de ces cellules à l’apoptose et la signature transcriptomique associée à l’athérosclérose. CARD9 est présent dans les plaques athéromateuses humaines, où la protéine est colocalisée avec les macrophages dans les zones riches en lipides qui entourent le corps nécrotique [ 9 ].
En conclusion, nous avons montré que l’absence de CARD9 induit une accélération de l’athérosclérose chez la souris, avec une augmentation de l’infiltration des macrophages dans la plaque athéromateuse et de la taille du corps nécrotique. Cet effet pro-athérogène est lié à un défaut d’autophagie, dépendant de CD36, dans les macrophages ( Figure 1 ), et disparaît si on traite les souris par la rapamycine ou la metformine, deux activateurs du flux autophagique [ 9 ].
