La plupart des travaux menés jusqu’à aujourd’hui abordent les effets du bisphénol A (BPA) comme étant des effets essentiellement de type œstrogénique. Bien que de tels effets aient été démontrés in vitro, leur démonstration in vivo reste peu probante et l’utilisation de modèles génétiquement modifiés propose également d’autres modes d’action possible.

L’utilisation de modèles génétiquement modifiés pour détecter une activité œstrogénique en réponse au BPA est encore peu développée au niveau des tissus suspectés d’être de potentielles cibles de ce perturbateur (ovaire, utérus, prostate...). Quelques études ont utilisé des souris ER-luciférase et les résultats apparaissent variables (tableau 31.I) et peu probants. Pourtant, de nombreux effets du BPA ont été rapportés chez l’adulte et chez le fœtus notamment à des doses faibles (allant jusqu’à 0,25 μg/kg/j). Cette discordance dans les observations pourrait provenir de la multiplicité des doses et des voies d’administration utilisées. Notons également que peu de travaux (voire aucun) ont utilisé des mutants pour les récepteurs nucléaires in vivo, ou sur culture d’organes pour tester les effets du BPA. Que les effets développementaux du BPA soient dus à une activité œstrogénique reste donc à établir.

Une approche intéressante et alternative est la transfection de constructions ERE-luciférase dans des cellules in vitro. Une illustration de cette approche est la transfection de cellules de Leydig fœtales par une construction ERE-luc qui a permis de démontrer l’activité œstrogénique du BPA in vitro dans ces cellules.

Enfin, sur une lignée de souris mutante pour l’aromatase, l’enzyme permettant la production d’œstrogène, souris ArKO, un traitement au BPA permet de restaurer les fonctions ovariennes et utérines (Toda et coll., 2002). Ce travail démontre bien une activité de type œstrogénique du BPA.

Des lignées transgéniques de poissons ont également été utilisées. Dans une première approche une construction de type ERE-tk-Luc a été introduite chez le zebrafish et l’exposition aux œstrogènes pendant la phase larvaire a montré une activation significative (200 fois à 1 microM sur des larves âgées de 35 jours). Un seuil de détection à 1 nM d’œstradiol a été observé (Legler et coll., 2000). Sur une lignée indépendante de zebrafish où un ERE a été placé en amont du promoteur de la vitellogénine et du gène de la GFP (ERE-zvtg1-GFP) une induction de l’expression de la GFP à une concentration de 0,01 μg/l d’éthynylœstradiol a été observée. L’ajout de BPA à une concentration de 1 000 μg/l a également été noté après 13 jours d’exposition, ce qui montre que le BPA est faiblement œstrogénique in vivo chez le poisson-zèbre (Chen et coll., 2010). La même dose de 1 000 μg/l induit l’expression de la GFP après 21 jours d’exposition dans une lignées mvtg1-GFP ou le promoteur du gène de la vitellogénine 1 de médaka a été fusionné à la GFP (Zeng et coll., 2005).

L’ensemble de ces données encore fragmentaires confirme la faible œstrogénicité du BPA in vivo puisque ce composé est 10 000 fois moins puissant que le ligand naturel in vivo (Chen et coll., 2010 ; Zeng et coll., 2010). Cela pose la question de savoir si les effets phénotypiques observés après l’exposition sont bien liés à une perturbation œstrogénique. Finalement, il faut noter qu’aucun des modèles transgéniques actuellement disponibles chez le poisson ne permet la détection d’une activation œstrogénique à des stades embryonnaires précoces.

Des systèmes similaires ont été également développés chez le Xénope. Ainsi, une lignée transgénique exprimant la GFP sous le contrôle du promoteur du gène TH-bZIP a été utilisée pour suivre les effets du bisphénol A sur la fonction thyroïdienne (Fini et coll., 2007). TH-bZIP est en effet un gène régulé par ces hormones et il a été montré que le bisphénol avait, comme cela a été montré chez les mammifères, un effet inhibiteur sur la fonction thyroïdienne (Fini et coll., 2007).

La quasi totalité des études menées chez les poissons téléostéens l’ont été en considérant que le BPA était un xéno-œstrogène et ont donc mesuré des paramètres phénotypiques liés a cette activité œstrogénique. Les principales espèces étudiées dans ces dispositifs sont le medaka (Oryzias latipes) et le zebrafish (Danio rerio) mais d’autres espèces comme la truite (Oncorhynchus mykiss), le killifish (Fundulus heteroclitus), parmi de nombreuses autres, ou même une espèce hermaphrodite comme Rivulus marmoratus ont été utilisées. Il n’est donc pas possible de dresser ici une liste exhaustive des travaux qui ont été menés. Ces modèles ont bien sûr l’avantage de tester la présence de molécules œstrogéniques directement dans les eaux en exposant directement les adultes ou les embryons. Il est ainsi possible assez directement de faire le lien entre un effet observé à une certaine concentration et les quantités de perturbateurs endocriniens présents dans une rivière donnée (Kashiwada et coll., 2002).

La capacité du BPA à activer des récepteurs des œstrogènes de différentes espèces a été étudiée. On observe des différences faibles au niveau des EC501 observées. Ainsi, Matthews et coll. (2002), dans un test sur cellules mammaires humaines (MCF-7), mené avec le domaine de fixation du ligand de ERα de différentes espèces lié au domaine de fixation à l’ADN de Gal4, obtiennent des valeurs de EC50 allant de 0,3 a 3 μM avec les activités les plus fortes pour les récepteurs de souris et de truite arc-en-ciel et des activités plus faibles pour les récepteurs de poulet ou de Xénope. Des résultats similaires ont été obtenus dans des modèles cellulaires de poisson (cellules gonadiques RTG-2 ; lignée d’hépatome PLHC1) (Ackermann et coll., 2002 ; Rutishauser et coll., 2004 ; Olsen et coll., 2005 ; Cosnefroy et coll., 2009). À notre connaissance, aucun test de ce type n’a encore été réalisé sur les ERβ clonés chez les poissons ou le Xénope.

Dans un premier type de test, les effets du bisphénol A sont étudiés en terme de toxicité générale sur des paramètres très intégrés : la survie (Nagel, 2002 ; Kashiwada et coll., 2002 ; Ishibashi et coll., 2005), la capacité de ponte (Shioda et Wakabayashi, 2000), la capacité des œufs à éclore (Shioda et Wakabayashi, 2000 ; Kashiwada et coll., 2002 ; Segner et coll. 2003), le développement normal des embryons (Pastva et coll., 2001 ; Duan et coll., 2008), la présence d’ovotestis c’est-à-dire l’apparition chez un poisson mâle d’une gonade comprenant à la fois les aspects des testicules et des ovaires (Kang et coll., 2002). L’ensemble de ces paramètres phénotypiques est utilisé dans un test bien cadré, le test DarT (Nagel, 2002). En se basant sur ce type d’expériences et bien que des différences parfois significatives puissent être observées d’un paramètre à l’autre et en fonction des dispositifs d’exposition utilisés, des effets à des doses à partir de 100 μg/l ont été obtenus.

D’autres tests mesurent des effets plus directement œstrogéniques et la plupart d’entre eux se focalisent sur la mesure de l’induction des vitellogénines chez les mâles. Ces protéines sont normalement produites par le foie chez les femelles, passent dans la circulation générale et vont s’accumuler dans l’œuf. L’exposition des mâles (zebrafish ou medaka) aux œstrogènes induit la synthèse de vitellogénine et cela offre donc un test simple pour mesurer les effets du BPA (Segner et coll., 2003 ; Van der Belt et coll., 2003 ; Yamaguchi et coll., 2005 ; Muncke et coll., 2007). Ceci a même débouché sur un test utilisé en routine, le test MolDarT qui permet de détecter des effets du BPA à des concentrations de 10 μM. De nombreuses autres espèces de poissons ont été utilisées dans ce type de test (Segner et coll., 2003 ; Van der Belt et coll., 2003 ; Pait et coll., 2003 ; Seo et coll., 2006). Lee et coll. (2002) ont observé des effets similaires en étudiant chez le medaka un autre gène sensible aux œstrogènes, la choriogénine : une induction après 6 jours de traitements à 50 μg/l de BPA a été obtenue. Finalement, il faut noter que des gènes différents, non liés à la vitellogénine, ont également été utilisés comme marqueurs : c’est le cas de ERα, AR, les aromatases, CYP19 (Min et coll., 2003 ; Tabata et coll., 2003 et 2004 ; Yamaguchi et coll., 2005 ; Lee et coll., 2006 ; Diotel et coll., 2010) avec des effets le plus souvent positifs mais parfois également des effets inhibiteurs sur leur niveau d’expression. En général, ces tests sont plus sensibles que les tests purement morphologiques et montrent un effet à des concentrations de 100 μg/l, la voie majoritaire d’exposition étant d’ajouter simplement, le plus souvent pendant quelques jours, le BPA dans l’eau des aquariums dans lequel vivent des mâles adultes.

Enfin, des travaux plus mécanistiques permettent d’affiner en termes moléculaires les effets du BPA. Des approches transcriptomiques ont permis de mettre en évidence le réseau de gènes modifiés après une exposition au BPA et de comparer celui-ci aux gènes dont l’expression est altérée par les œstrogènes. Ceci a été fait chez le zebrafish (Kausch et coll., 2008) et chez la carpe (Moens et coll., 2006 et 2007) et dans les deux cas les gènes exprimés dans le foie ont été étudiés. Les résultats dans les deux espèces montrent que le BPA régule une série de gènes spécifiques différents de ceux régulés par les œstrogènes. Mais si dans les expériences menées chez la carpe le profil transcriptionnel du BPA est globalement proche de celui observé avec des produits clairement œstrogéniques comme l’éthynylœstradiol, ce n’est pas le cas chez le zebrafish. Chez cette espèce, 211 gènes sont régulés par les œstrogènes alors que seulement 47 le sont par le bisphénol. Les seuls gènes en commun régulés par les deux produits sont les vitellogénines. Ces résultats posent la question de la validité des approches visant à conclure à l’œstrogénicité d’un produit en utilisant simplement l’induction de ces gènes comme critère. La comparaison détaillée des profils transcriptionnels générés par le BPA et les œstrogènes apportera certainement des éléments clefs pour mieux caractériser les effets de ce produit en termes de mécanismes d’action.

Un modèle amphibien, le xénope (Xenopus laevis), a également été utilisé pour caractériser les effets du BPA. Des traitements de têtards à des doses de 10 ou 100 nM de BPA induisent une féminisation de ces derniers bien que cet effet ne soit pas retrouvé dans tous les types de traitements effectués, notamment lorsqu’on modifie la période d’exposition (Pickford et coll., 2003 ; Levy et coll., 2004). Comme chez les poissons, le BPA peut induire l’expression ou la synthèse de vitellogénine chez le xénope mais il n’est que faiblement actif par rapport à l’œstradiol puisqu’il ne montre que 0,008 % de l’activité du 17β-œstradiol (Mitsui et coll., 2007).

Des effets différents, agissant sur d’autres voies de signalisation que celle des ER ont également été observés chez le Xénope. Une exposition à des doses de 20 μM de BPA à des stades précoces de développement (avant le stade 10) induit des malformations de la région céphalique, associées à l’induction d’une apoptose dans le cerveau et la mœlle épinière des animaux traités (Oka et coll., 2003 ; Sone et coll., 2004). Cet effet développemental a été associé à des anomalies de la voie Notch et le BPA est en fait capable d’inhiber l’activité de la gamma-secrétase (Imaoka et coll., 2007 ; Baba et coll., 2009). Plus récemment, une activité du BPA sur la voie des hormones thyroïdiennes et donc sur le contrôle de la métamorphose a été mise en évidence (Heimeier et Shi, 2010). Le BPA à des doses fortes (20 μM) entraîne une décélération de la métamorphose induite par les hormones thyroïdiennes et diminue l’expression du récepteur TRβ (Iwamuro et coll., 2003). Cet effet a été reproduit à des doses plus faibles (0,1 μM) sur des cultures de queues de têtard et ces auteurs ont également montré un effet sur l’expression RXRγ, le partenaire d’hétérodimérisation de TRβ (Iwamuro et coll., 2006). En focalisant leur étude sur le remodelage intestinal induit par les hormones thyroïdiennes au cours de la métamorphose, Heimeier et coll. (2009) ont montré un effet clairement antagoniste du BPA, capable d’inhiber l’action régulatrice des hormones thyroïdiennes sur de nombreux gènes cibles. Ces données montrent donc que le spectre d’action du BPA est bien plus large que la seule action œstrogénique communément admise.

En conclusion, chez les mammifères, l’utilisation de modèles génétiquement modifiés pour détecter une activité œstrogénique en réponse au BPA est encore peu développée au niveau des tissus suspectés d’être de potentielles cibles de ce perturbateur (ovaire, utérus, prostate...).

Parallèlement, des lignées transgéniques de poissons confirment la faible œstrogénicité du BPA in vivo. Aucun des modèles transgéniques actuellement disponibles chez le poisson ne permet la détection d’une activation œstrogénique à des stades embryonnaires précoces.

La quasi-totalité des études menées chez les poissons téléostéens (medaka, zebrafish) ou d’autres espèces comme la truite, le killifish... ont mesuré des paramètres phénotypiques liés à une activité œstrogénique. Ces modèles ont l’avantage de tester la présence de molécules œstrogéniques directement dans les eaux en exposant directement les adultes ou les embryons.

Par des approches transcriptomiques, réalisées chez le zebrafish et la carpe, les gènes exprimés dans le foie ont été étudiés. Les résultats montrent que le BPA régule une série de gènes spécifiques différents de ceux régulés par les œstrogènes. Ces résultats posent la question de la validité des approches visant à conclure à l’œstrogénicité d’un produit en utilisant simplement l’induction de ces gènes comme critère. La comparaison détaillée des profils transcriptionnels générés par le BPA et les œstrogènes apportera certainement des éléments clefs pour mieux caractériser les effets de ce produit en termes de mécanismes d’action.

De nouveaux modèles d’études, notamment les cellules humaines, pour caractériser chez l’homme les effets et les mécanismes d’actions du BPA et de ses éventuels produits de substitution s’avèrent indispensables. Les futures évaluations de risque produites par les agences sanitaires devront intégrer ces nouvelles approches.

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