Dans de nombreux cas de bactéries pathogènes à Gram négatif, des protéines nécessaires à la virulence sont exportées dans l’environnement, qu’il soit ou non la cellule eucaryote elle-même. Pour pouvoir traverser la paroi bactérienne, ces protéines doivent franchir les deux obstacles que sont la membrane interne et la membrane externe, toutes deux hydrophobes et donc imperméables aux composés hydrophiles. Pour ce faire, elles ont besoin de systèmes de sécrétion. Quatre systèmes de sécrétion de protéines sont actuellement connus chez les bactéries à Gram négatif: les types I à IV [1].

Les types I sont responsables de la sécrétion d’enzymes extracellulaires par les bactéries à Gram négatif, comme la sécrétion d’hémolysine α chez Escherichia coli, de l’adé-nylate cyclase chez Bordetella pertussis, de protéases chez Pseudomonas aerugi-nosa [2]. La sécrétion par des systèmes de type II met en jeu un système particulier, dit système sec, comprenant différentes protéines, dont une ATPase, une protéine chaperon et une peptidase. Les protéines exportées par ces systèmes possèdent une séquence d’acides aminés hydrophobes, dite « séquence signal », qui est nécessaire à leur exportation mais sera éliminée par la peptidase dans l’espace périplasmique. Ces systèmes sont responsables de la sécrétion d’enzymes pectiques et de cellulases par Erwi-nia, d’élastase, de phospholipase C et d’exotoxine A par P . aeruginosa, de pullanase par Klebsiella oxytoca [3].

Les deux types suivants sont utilisés lors de la sécrétion de protéines au cours d’un contact avec les cellules.

Le type III est certainement le mécanisme de sécrétion le plus étudié [4]. Il met en jeu une vingtaine de protéines, dont beaucoup sont des homologues des composants de la biosynthèse des flagelles. Ce système permet la sécrétion de protéines responsables de l’adhérence de la bactérie à la surface cellulaire (E. coli entéropathogènes), de l’entrée de la bactérie dans des cellules non phagocytaires (Salmonella typhimurium, Shigella spp., Yersinia spp.) ou au contraire de la résistance à la phagocytose par les macrophages (P. aeruginosa, Yersinia spp.), d’induction de l’apoptose des macrophages [5]. Les protéines bactériennes sécrétées interagissent avec des protéines cellulaires (protéines G, tyrosine kinases, adénylate cyclase, etc.), conduisant, entre autres effets, à la réorganisation de l’actine du cytosquelette et à la phagocytose, ou, au contraire, à la dépolymérisation de l’actine et à l’inhibition de la phagocytose, ou encore à l’apoptose. L’activité des systèmes de sécrétion de type III est réglée à la fois aux niveaux transcriptionnel et post-traductionnel.

Le dernier système connu est la voie de sécrétion de type IV. Ce système permet la sécrétion de complexes nucléoprotéiques ou protéiques à travers la membrane des bactéries à Gram négatif [6]. Les plus connus jouent un rôle majeur dans l’échange de plasmides au cours de la conjugaison bactérienne, par exemple le système tra chez E. coli. Plus récemment, il a été démontré que ces systèmes de type IV jouent un rôle important dans la virulence de certaines bactéries, ce qui fait l’objet de cet article.

Il est cependant possible que d’autres systèmes de sécrétion existent chez les bactéries, comme les systèmes dits « autotransporteurs » de Neisseria gonorrhoeæ ou d’Helicobacter pylori.

Le plus anciennement décrit et le mieux connu des systèmes de type IV impliqués dans la virulence est celui d’Agrobacterium tumefaciens, une bactérie pathogène pour les plantes (→). Récemment, de tels systèmes ont été retrouvés chez des bactéries pathogènes pour l’homme et les animaux (Figure 1, Tableau I) [7].

(→) m/s 2001, n°8/9, p. 856

Figure 1. Les systèmes de type IV chez les bactéries pathogènes. Les systèmes de sécrétion de type IV sont présents chez quelques bactéries pathogènes avec des comportements différents. Chez Agrobacterium et Helicobacter, la sécrétion de la molécule effectrice dans la cellule eucaryote receveuse nécessite un mécanisme dépendant du contact. Bordetella sécrète, dans le milieu extérieur, sa toxine (PT) par le système Ptl. Dans le cas des bactéries intracellulaires (Legionella, Rickettsia et Brucella), le système de sécrétion de type IV permet la survie de la bactérie dans la vacuole de phagocytose. La nature des protéines effectrices est encore inconnue chez ces bactéries, mais on peut supposer qu’elles interviennent sur le trafic intracellulaire de la vacuole d’endocytose, soit en modifiant la surface du phagosome, soit par interaction avec les cascades de signalisation des voies d’endocytose, pour diriger la bactérie vers une niche intracellulaire spécifique, favorable à sa survie.

Figure 1. Les systèmes de type IV chez les bactéries pathogènes. Les systèmes de sécrétion de type IV sont présents chez quelques bactéries pathogènes avec des comportements différents. Chez Agrobacterium et Helicobacter, la sécrétion de la molécule effectrice dans la cellule eucaryote receveuse nécessite un mécanisme dépendant du contact. Bordetella sécrète, dans le milieu extérieur, sa toxine (PT) par le système Ptl. Dans le cas des bactéries intracellulaires (Legionella, Rickettsia et Brucella), le système de sécrétion de type IV permet la survie de la bactérie dans la vacuole de phagocytose. La nature des protéines effectrices est encore inconnue chez ces bactéries, mais on peut supposer qu’elles interviennent sur le trafic intracellulaire de la vacuole d’endocytose, soit en modifiant la surface du phagosome, soit par interaction avec les cascades de signalisation des voies d’endocytose, pour diriger la bactérie vers une niche intracellulaire spécifique, favorable à sa survie.

Tableau I. Les substrats des systèmes de type IV.

Tableau I. Les substrats des systèmes de type IV.

Agrobacterium tumefaciens

L’infection d’une plante par A. tumefaciens se traduit par l’apparition de tumeurs du collet, appelées crown-galls. La bactérie infecte d’abord les cellules de la plante, puis lui transfère un plasmide, qui va s’intégrer dans son génome. Ce plasmide, nommé pTi (pour tumor-inducing), contient à la fois des gènes responsables de son transfert et des gènes de synthèse de facteurs de croissance, déréglant la multiplication des cellules de la plante et conduisant à la formation de la tumeur [8]. Le transfert du plasmide se fait par l’intermédiaire d’un complexe protéique situé dans la paroi de la bactérie [9]. Ce complexe protéique, VirB, met en jeu onze protéines codées par onze gènes formant la région virB du plasmide et réunis en opéron (Figure 2). Plusieurs macromolécules sont exportées par VirB sous forme d’un complexe nucléoprotéique (voir cidessous). Les protéines VirB de A. tumefaciens présentent une homologie importante avec les protéines d’E. coli impliquées dans le transfert de plasmides, tels ceux des groupes IncP (protéines Tra) ou IncW (protéines Trw), au cours de la conjugaison. Enfin, la présence d’un deuxième système de type IV sur le plasmide Ti vient d’être démontrée.

Figure 2. Organisation des systèmes de sécrétion de type IV. Alignement de différents systèmes de sécrétion illustrant la conservation de l’organisation entre les systèmes conjugatifs ou le système de transfert de l’ADN-T de Agrobacterium tumefaciens et les systèmes de sécrétion impliqués dans la virulence de bactéries pathogènes.

Figure 2. Organisation des systèmes de sécrétion de type IV. Alignement de différents systèmes de sécrétion illustrant la conservation de l’organisation entre les systèmes conjugatifs ou le système de transfert de l’ADN-T de Agrobacterium tumefaciens et les systèmes de sécrétion impliqués dans la virulence de bactéries pathogènes.

Les systèmes de sécrétion de type IV sont assemblés à partir des éléments constitutifs de la machinerie conjugative. L’analyse du système VirB de A. tumefaciens a permis d’identifier trois groupes fonctionnels de protéines VirB (Figure 3) [28, 29].

Figure 3. Structure des systèmes de type IV. Localisation des composants VirB du système de transfert de l’ADN-T chez Agrobacterium tumefaciens. Les protéines VirB et VirD4 sont regroupées selon leur fonction probable: les protéines exocellulaires impliquées dans l’attachement à la cellule receveuse (VirB1*, VirB2 et VirB5), les protéines formant le pore (VirB3, VirB6, VirB7, VirB8, VirB9 et VirB10), et les ATPases de la membrane cytoplasmique (VirB4, VirB11 et VirD4).

Figure 3. Structure des systèmes de type IV. Localisation des composants VirB du système de transfert de l’ADN-T chez Agrobacterium tumefaciens. Les protéines VirB et VirD4 sont regroupées selon leur fonction probable: les protéines exocellulaires impliquées dans l’attachement à la cellule receveuse (VirB1*, VirB2 et VirB5), les protéines formant le pore (VirB3, VirB6, VirB7, VirB8, VirB9 et VirB10), et les ATPases de la membrane cytoplasmique (VirB4, VirB11 et VirD4).

Si de nombreux systèmes de type IV assurent le transport d’ADN, il faut toutefois noter que, dans ce cas, le substrat de conjugaison n’est jamais de l’ADN nu, mais del’ADN simple brin associé à des protéines. Les protéines ainsi co-transportées interagissent avec l’origine de transfert (oriT) pour former le complexe de transfert. Au cours de la conjugaison, les cellules donneuses engendrent un intermédiaire de transfert, comprenant l’ADN simple brin lié de façon covalente à son extrémité 5’ avec une endonucléase et, sur toute sa longueur, des protéines se liant à l’ADN simple brin. La reconnaissance de ce complexe nucléoprotéique par la machinerie de sécrétion est encore mal connue. L’hypothèse la plus vraisemblable est que la reconnaissance du substrat est conférée par les protéines associées, qui possèderaient des séquences peptidiques conservées ou encore des motifs de reconnaissance engendrés lors de leur repliement. L’appareil de conjugaison serait alors un système de sécrétion de protéines de type IV, permettant le transfert d’ADN associé [34]. Le transfert de l’ADN-T par A. tumefaciens ressemble beaucoup au processus de conjugaison. On observe en effet la formation du complexe T, qui est une association de l’ADN simple brin avec la protéine VirE2 et une endonucléase, la protéine VirD2, liée en 5’. Un argument confirmant l’hypothèse selon laquelle la machinerie de sécrétion reconnaît des protéines comme substrat est que la protéine VirE2 SSB (single strand binding protein) ou encore la protéine VirF de A. tumefaciens peuvent être sécrétées dans la cellule hôte de la plante indépendamment du complexe ADN-T/VirD2 [35, 36]. La machinerie de transfert de l’ADN-T de A. tumefaciens peut donc transporter les protéines VirE2, VirF, le complexe nucléoprotéique, mais elle est également capable de mobiliser des plasmides tels que le plasmide RSF1010. Ce transfert du plasmide RSF1010, comme dans le cas de Legionella, s’effectue au détriment des autres substrats, par un processus de compétition pour les systèmes de sécrétion disponibles [19, 37]. Une étude récente a en outre démontré le transfert possible de la protéine RecA par le système de conjugaison du plasmide RP4 chez Escherichia coli [34] et apporte un argument supplémentaire en faveur d’une composante protéique dans le processus de sécrétion.

Dans le cas de sécrétion de protéines, des études récentes proposent l’intervention de protéines chaperons. En effet, chez A. tumefaciens, la protéine VirE1, nécessaire à la sécrétion de la protéine VirE2, est une petite protéine de type chaperon qui stabilise la protéine sécrétée VirE2 SSB [38]. Même si VirE1 en est à ce jour le seul exemple, la sécrétion de protéines par les systèmes de type IV requiert vraisemblablement des protéines annexes qui maintiennent le substrat dans un état de repliement compatible avec son transfert.

Les processus de transport varient suivant la nature du substrat exporté. Dans le cas de la conjugaison ou dutransfert du complexe T chez A. tumefaciens, l’ADN doit rester intact pendant le processus. Le périplasme contenant de nombreuses nucléases susceptibles de dégrader l’ADN simple brin, la sécrétion d’ADN et des protéines associées est donc supposée se faire en une seule étape. Le système de sécrétion Ptl de la toxine de B. pertussis paraît différent sur plusieurs points. D’abord, un processus de sécrétion en deux étapes a été proposé. En effet, la toxine pertussique est formée de 5 sous-unités (S1-S5) qui possèdent chacune une séquence signal. Ces sous-unités doivent donc traverser la membrane interne par la voie générale de sécrétion dépendante de sec. La toxine est ensuite assemblée dans le périplasme avant d’être exportée à travers la membrane externe par le système de type IV. On a ensuite remarqué que, parmi les protéines VirB essentielles chez A. tumefaciens (VirB2-B11), seule VirB5 ne trouve pas son homologue chez B. pertussis. Une hypothèse a été avancée, selon laquelle la protéine VirB5 (ainsi que ses homologues Tra) serait nécessaire à la formation et au transfert du complexe protéine-ADN. Cependant, la région virB de B. suis possède un équivalent de virB5, ce qui ne confirme pas cette proposition, puisque, chez cette bactérie, le complexe VirB exporte très probablement une ou des protéines. Enfin, une autre différence importante caractérise B. pertussis. En effet, la toxine bactérienne est sécrétée dans le milieu extérieur et ne devrait pas nécessiter, contrairement aux autres substrats, un contact avec une cellule receveuse et donc n’exigerait pas la présence d’un pilus. Pourtant, il faut remarquer que la protéine PtlA de B. pertussis est l’homologue de la protéine VirB2 de A. tumefaciens, ce qui suggère que le système Ptl a conservé une trace de structure de type pilus.

Les systèmes de sécrétion de type IV ont donc comme fonctions connues soit le transfert de nucléoprotéines au cours de la conjugaison, soit celui de protéines pures, dans le cadre de la virulence. Actuellement, les premiers sont les mieux connus et les plus représentés dans le monde bactérien. En effet, la sécrétion d’holoprotéines n’a été démontrée que chez B. pertussis et H. pylori, et n’est que probable chez L. pneumophila et B. suis. Dans ces conditions, il est logique de penser que les systèmes de sécrétion d’holoprotéines sont dérivés des systèmes de conjugaison. Les arbres phylogénétiques construits à partir des séquences des différentes protéines formant l’opéron vont dans ce sens [39]. Il faut cependant noter que cette phylogénie moléculaire souffre, dans le cas des systèmes de type IV, de plusieurs insuffisances: d’une part, les séquences des gènes équivalents chez différentes bactéries sont trop divergentes pour permettre une interprétation statistiquement indiscutable de l’ordre des embranchements dans ces arbres ; d’autre part, la racine de ces arbres est le plus souvent placée de manière aléatoire. Ces deux inconvénients rendent difficile la désignation des lignées les plus anciennes.

Une étude récente portant sur la phylogénie de 148 gènes de sécrétion de protéines homologues de VirB11, qui sont communes aux systèmes de type II et de type IV, vient de montrer que l’évolution de ces systèmes est beaucoup plus complexe qu’on ne l’a d’abord pensé [40]. L’arbre phylogénétique de ces différents gènes montre qu’ils forment une superfamille, divisée en deux familles correspondant aux systèmes de type II et de type IV, toutes deux dérivant d’un ancêtre commun (Figure 4). Les systèmes de type II ont pour unique fonction de sécréter des holoprotéines. Dans la famille dessystèmes de type IV, on observe une dispersion des systèmes engagés dans la conjugaison et de ceux responsables de la sécrétion d’holoprotéines, les deux étant regroupés ensemble dans plusieurs branches de l’arbre. Les conclusions de ces auteurs sont que: (1) il est difficile aujourd’hui de faire une proposition simple expliquant les relations évolutives entre les systèmes de conjugaison et de virulence; (2) comme le transfert d’ADN exige son couplage avec des protéines, la distinction entre les deux fonctions est peute tre artificielle.

Figure 4. Arbre phylogénétique des homologues de virB11 appartenant à des systèmes de sécrétion de type II et de type IV [40]. Les distances évolutives (longueur des branches) sont arbitraires, mais les embranchements sont respectés. La partie bleue correspond au groupe virB11 proprement dit, qui a été plus détaillé. Les gènes se distribuent en deux familles, correspondant aux systèmes de type II et de type IV. Les gènes de sécrétion de protéines pures (Helicobacter, Bordetella et probablement Brucella) sont entremêlés avec des gènes de transfert de plasmides (gène lvh de Legionella, Agrobacterium) et donc ne dérivent pas d’un ancêtre commun. Le produit excrété par le complexe VirB de B. henselae n’est pas connu pour le moment. Enfin, une protéine sécrétée permettant l’adhérence de A. actinomycetemcomitans est codée par un gène du groupe tadA qui, par ailleurs, contient de nombreux systèmes de conjugaison.

Figure 4. Arbre phylogénétique des homologues de virB11 appartenant à des systèmes de sécrétion de type II et de type IV [40]. Les distances évolutives (longueur des branches) sont arbitraires, mais les embranchements sont respectés. La partie bleue correspond au groupe virB11 proprement dit, qui a été plus détaillé. Les gènes se distribuent en deux familles, correspondant aux systèmes de type II et de type IV. Les gènes de sécrétion de protéines pures (Helicobacter, Bordetella et probablement Brucella) sont entremêlés avec des gènes de transfert de plasmides (gène lvh de Legionella, Agrobacterium) et donc ne dérivent pas d’un ancêtre commun. Le produit excrété par le complexe VirB de B. henselae n’est pas connu pour le moment. Enfin, une protéine sécrétée permettant l’adhérence de A. actinomycetemcomitans est codée par un gène du groupe tadA qui, par ailleurs, contient de nombreux systèmes de conjugaison.

Grâce au séquençage systématique des génomes bactériens, le nombre des espèces chez qui un système de sécrétion de protéines de type IV est découvert ne cesse d’augmenter. Cependant, plusieurs inconnues demeurent. D’abord, il reste à déterminer si ces nouveaux systèmes jouent un rôle dans la conjugaison ou dans la virulence. Ensuite, si la structure du pore commence à être assez bien connue chezA. tumefaciens, elle est peu étudiée chez les autres bactéries. Il serait intéressant que cette connaissance soit élargie à ces autres exemples. En effet, chez les espèces dont la virulence dépend d’un tel système de sécrétion, on peut espérer découvrir des molécules capables de bloquer le transport des protéines de virulence et donc l’expression du pouvoir pathogène de ces bactéries. De telles substances pourraient servir de médicaments antibactériens non antibiotiques, permettant d’améliorer la thérapeutique des maladies correspondantes pour diverses raisons: soit en relais d’antibiotiques dont l’efficacité est amoindrie par les conditions environnantes (par exemple, le pH acide du contenu gastrique ou du phagosome), soit en bloquant de manière précoce la sécrétion de toxines responsables principales du tableau clinique (comme dans le cas de la coqueluche).