Des données provenant de systèmes divers démontrent que la chromatine stimule la polymérisation des microtubules lors de la formation du fuseau (Figure 2).

Dans des spermatocytes de sauterelle Melanoplus differentialis, une série d’expériences a suggéré que les chromosomes sont indispensables à l’assemblage des microtubules du fuseau: l’ablation partielle des chromosomes provoque une réduction de la quantité totale des microtubules du fuseau. Cette réduction n’est pas proportionnelle au nombre de kinétochores absents mais à la masse de chromatine éliminée [8]. Dans ces mêmes cellules en interphase, la libération dans le cytoplasme du contenu du noyau, par micro-perforation de l’enveloppe nucléaire, induit la formation prématurée d’un fuseau bipolaire. Les facteurs nécessaires à cette « activation nucléaire » sont associés à la chromatine [9]. Ces observations ont été corroborées par des résultats d’expériences réalisées avec des extraits d’œufs de xénope [10]. En particulier, l’étude de la cinétique de polymérisation de microtubules provenant de centrosomes a révélé que lorsque ces microtubules sont en contact avec de la chromatine, leur fréquence de « catastrophes » diminue alors que celle des « sauvetages » (transition d’un état de dépolymérisation à un état de polymérisation) augmente [11]. L’ensemble de ces résultats suggère que la chromatine inverse localement la déstabilisation globale des microtubules en phase M.

Cet « effet chromatine » a été également mis en évidence dans des systèmes dépourvus de centrosome. La microinjection de noyaux issus de karyoplastes, ou l’injection d’ADN de phage, dans des œufs de grenouille non fertilisés bloqués en métaphase (et dépourvus de centrosome), provoque la formation de réseaux bipolaires de microtubules autour de la chromatine [12]. De même, l’introduction dans des extraits d’œufs de xénope de billes magnétiques recouvertes d’ADN non spécifique, ou « billes de chromatine », induit la formation d’un fuseau bipolaire autour d’elles [13]. Il faut noter que l’orientation des microtubules est identique (extrémités [-] aux pôles du fuseau et extrémités [+] vers la plaque métaphasique) dans tous les types de fuseaux répertoriés, ce qui suggère pour tous un même mécanisme d’assemblage du fuseau [14]. Enfin, un fuseau bipolaire peut s’assembler dans des cellules somatiques de mammifère après ablation de leurs centrosomes [15]. Dans tous ces systèmes, la chromatine seule est donc capable d’induire l’assemblage de microtubules dans un cytoplasme déstabilisant, indépendamment de sources prédéfinies de microtubules.

Les premières protéines potentiellement impliquées dans cet « effet chromatine » ont été caractérisées dans les extraits d’œufs de xénope. Parmi celles-ci, la Stathmine/Op18 est un facteur déstabilisant les microtubules, actif lorsqu’il est déphosphorylé et inactivé par la phos-phorylation [16]. Dans des extraits d’œufs en phase M, Op18 est maintenue sous sa forme active, probablement par la phosphatase PP2A. L’ajout de billes de chromatine à l’extrait induit la phosphorylation d’Op18 [17], suggérant l’existence d’une kinase associée à la chromatine [17, 18] capable d’inactiver localement Op18, rendant ainsi les microtubules mitotiques plus stables près de la chromatine.

Une avancée considérable dans la compréhension de l’« effet chromatine » provient de la mise en évidence d’un rôle régulateur « mitotique » de la protéine Ran, une petite GTPase de la famille des Ras² [20, 21] (Figure 3). Dans des extraits d’œufs de xénope, Ran, associée au GTP, déclenche l’assemblage de microtubules et leur organisation en fuseau en l’absence de centrosomes, voire même de chromosomes [19]. De plus, RCC1, le facteur d’échange qui active Ran, est associé aux chromosomes [20, 21] et se trouve fortement concentré sur les billes de chromatine dans ces extraits. L’assemblage d’un fuseau autour des billes de chromatine dépend de la production de Ran-GTP par la chromatine même [22]. Ran-GTP pourrait être ainsi le principal activateur de l’« effet chromatine » dans ce type de fuseau [19]. Ran-GTP règle aussi l’assemblage de microtubules du centrosome. Dans ces extraits, Ran-GTP est nécessaire à l’assemblage d’un fuseau qui contient des centrosomes et des kinétochores, et provient de spermatozoïdes [23]. Les microtubules reliant centrosomes et kinétochores ne suffisent donc pas à la formation d’un fuseau bipolaire robuste. En conclusion, l’« effet chromatine » relayé par Ran est commun et nécessaire à la formation de fuseaux en présence ou en l’absence de sources prédéfinies de microtubules (centrosomes). En accord avec les résultats obtenus in vitro, la régulation de l’assemblage de microtubules par Ran a récemment été mise en évidence in vivo, dans des cellules de mammifères et chez la levure [24, 25]. Quant aux effecteurs de Ran, ils commencent seulement à être caractérisés [19].

L’ensemble de ces résultats démontre que la chromatine stimule l’assemblage des microtubules durant la formation du fuseau. Cet « effet chromatine » semble être le principal mécanisme responsable de l’assemblage et du maintien des microtubules du fuseau au sein d’un cytoplasme déstabilisant en phase M.

La fonction des kinétochores lors de la division cellulaire est d’assurer la ségrégation rigoureuse des chromosomes entre les deux cellules filles. Les kinétochores définissent une sous-population très particulière de microtubules du fuseau. Chez tous les eucaryotes supérieurs, les microtubules kinétochoriens sont ancrés par leur extrémité (+) dans la face externe du kinétochore et sont organisés en un faisceau dense appelé « fibre kinétochorienne ». Le nombre de microtubules qui composent la fibre kinétochorienne est variable selon les espèces [30]. Les microtubules kinétochoriens représentent une sous-population de microtubules du fuseau variable selon les systèmes cellulaires (25 % dans les cellules de mammifères, 100 % chez C. elegans dont les kinétochores, appelés holocentriques, recouvrent la totalité du chromosome). Ces microtubules sont caractérisés par une stabilité accrue: leur demi-vie est quatre fois supérieure à la demi-vie moyenne des microtubules du fuseau. La fibre kinétochorienne est une structure robuste, résistante en particulier à des manipulations mécaniques [31]. Ces fibres contribuent de façon significative à la stabilisation du fuseau de division. La perturbation de la fonction de la kinésine CENP-E, essentielle comme nous le verrons ultérieurement à la formation de ces fibres, peut induire la perte de cohésion générale du fuseau dont les pôles se désagrègent [32, 33]. Cette stabilité de la fibre kinétochorienne assure en outre l’association stable de chaque chromosome aux deux pôles du fuseau (bi-orientation), nécessaire pour leur ségrégation rigoureuse dans les cellules filles.

Les kinétochores contribuent également aux mouvements des chromosomes qui conduisent à leur alignement sur la plaque métaphasique, puis à leur migration vers les pôles en anaphase. Ces mouvements dépendent en partie des forces que produit la dépolymérisation des microtubules de la fibre kinétochorienne [34]. Jusqu’en métaphase, des phases de dépolymérisation/polymérisation se succèdent sur chaque kinétochore. Le « raccourcissement » d’une fibre kinétochorienne est associé, pour les chromosomes bi-orientés, à la polymérisation de la fibre kinétochorienne opposée. Ce processus suppose la coordination rigoureuse du contrôle de la dynamique des microtubules par la paire de kinétochores [35]. En anaphase, la dépolymérisation des fibres kinétochoriennes devient continue et assure la migration des chromosomes jusqu’aux pôles du fuseau. Une exception notable est le cas des fuseaux assemblés dans les extraits d’œufs de xénope: en anaphase, la migration des chromosomes est en effet assurée uniquement par le flux des microtubules vers les pôles [36].

Ainsi, pendant toute la durée de la mitose, chaque kinétochore a un effet globalement stabilisant sur les microtubules kinétochoriens mais permet, parallèlement, la dépolymérisation ponctuelle de l’ensemble des microtubules qui constituent la fibre kinétochorienne.

La formation et le fonctionnement de la fibre kinétochorienne impliquent les activités de différents moteurs moléculaires et de MAP, associés durant la mitose aux kinétochores (Figure 4).

Dès la rupture de l’enveloppe nucléaire, les microtubules des centrosomes interagissent de façon aléatoire avec les kinétochores grâce à un mécanisme dit de « recherche et capture » [37]. Ce mécanisme pourrait impliquer la MAP CLIP-170 (cytoplasmic linker protein). Initialement décrite comme nécessaire à l’ancrage de structures complexes aux microtubules; cette protéine est associée au kinétochore jusqu’à la mise en place de la fibre kinétochorienne [38]. Cette capture entraîne ensuite le transport du kinétochore vers le pôle du fuseau grâce à la dynéine [39]. En début de mitose, ce mouvement favorise l’ancrage de microtubules au kinétochore mais ne semble pas nécessaire à la formation de la fibre kinétochorienne [40].

Des expériences récentes démontrent que l’ancrage et le maintien des extrémités (+) des microtubules dans le kinétochore nécessitent l’action de la kinésine kinétochorienne CENP-E [32]. L’inhibition de CENP-E dans des cellules empêche la bi-orientation d’une partie des chromosomes. Ceux-ci sont immobilisés près des pôles du fuseau sans fibre kinétochorienne. Les chromosomes bi-orientés observés sont, quant à eux, pourvus de fibres dont la densité en microtubules est réduite en moyenne de 23 % [33]. Ces résultats confirment le rôle crucial de CENP-E, mais suggèrent également l’implication d’autres facteurs non encore identifiés dans la formation de la fibre kinétochorienne.

Les mécanismes de stabilisation proprement dits de la fibre restent largement hypothétiques. La densité de microtubules dans la fibre pourrait permettre la concentration locale de MAP stabilisatrices. Par ailleurs, cette densité pourrait favoriser des interactions directes entre les dimères de tubuline appartenant à des microtubules adjacents, contribuant à la stabilité de la fibre. Ces hypothèses restent à confirmer.

Les facteurs contrôlant la dépolymérisation ponctuelle de la fibre kinétochorienne sont peu connus. CENP-E, initialement décrite comme une kinésine nécessaire à l’alignement des chromosomes en métaphase [41], ne semble pas impliquée directement dans de tels mouvements. En effet, si in vitro, ce moteur est requis pour maintenir l’attachement des kinétochores aux extrémités (+) de microtubules en phase de dépolymérisation [42], l’inhibition de CENP-E ne perturbe pas la mobilité des chromosomes bi-orientés in vivo [41]. En revanche, la kinésine XKCM1 et son homologue chez les mammifères MCAK (mitotic centromere-associated kinesin) qui favorisent les événements de « catastrophes » et sont associées aux kinétochores en mitose, pourraient être impliqués dans la dépolymérisation ponctuelle de la fibre kinétochorienne [43, 44]. L’inhibition de MCAK dans des cellules inhibe complètement les mouvements des chromosomes en anaphase [45]. Le rôle de XKCM1/MCAK avant la métaphase reste à élucider. Cette protéine pourrait contrôler la dépolymérisation des microtubules kinétochoriens en synergie avec d’autres facteurs encore inconnus.

Ainsi, à l’échelle du kinétochore, se déroule un jeu subtil de stabilisation globale et de déstabilisation locale et ponctuelle des microtubules du fuseau. Si la fibre kinétochorienne n’est pas strictement nécessaire à la formation d’un fuseau bipolaire, elle contribue néanmoins à sa stabilisation. Ce jeu de stabilisation globale et de déstabilisation ponctuelle est essentiel au contrôle de la ségrégation rigoureuse des chromosomes par les kinétochores.