La répression de transgènes multiples chez D. melanogaster a été étudiée, entre autres, grâce à miniwhite [ 1], un transgène dont l’expression peut être détectée en observant directement la couleur de l’œil. Les individus porteurs d’un allèle white sauvage ont les yeux rouges, alors que ceux qui en sont dépourvus ont les yeux blancs. L’insertion d’une copie unique du transgène miniwhite dans le génome de mouches mutantes pour le gène white produit des mouches aux yeux rouges, ce qui indique que miniwhite est normalement exprimé. Mais lorsque plusieurs copies du transgène sont présentes, les mouches ont les yeux blancs. Le transgène n’est donc plus exprimé dans ces conditions. Au moins deux gènes de D. melanogaster sont impliqués dans l’extinction des copies multiples de miniwhite. Le premier code pour la protéine Enhancer of zeste (E[z]) qui appartient au groupe Polycomb regroupant des répresseurs qui agissent en complexes multimoléculaires maintenant la chromatine dans un état transcriptionnellement inactif [ 2]. Récemment, trois études indépendantes (pour revue, voir [2]) ont montré que E(z) a une activité méthylase. De telles activités enzymatiques sont essentielles au cours de la mise en place des états réprimés ou déréprimés de la chromatine. Elles agissent en modifiant l’extrémité aminoterminale des histones [ 3], protéines associées à la chromatine. Le second gène requis pour l’extinction des copies multiples de miniwhite code pour la protéine HP1, dont on observe, sur des chromosomes polytènes de glandes salivaires de larves, qu’elle se fixe sur les transgènes miniwhite éteints. HP1 est un composant de la chromatine. Chez les mammifères, on a démontré que HP1 est nécessaire à la méthylation de la lysine 9 de l’histone H3, une modification chimique associée à un état chromatinien transcriptionnellement inactif.

L’identification de gènes impliqués dans la répression des copies multiples du transgène miniwhite suggère que le contrôle des séquences répétées a lieu, au moins en partie, au niveau transcriptionnel. Cette observation est supportée par d’autres études. Ainsi, lorsque des copies multiples du transgène w-Adh, contenant le gène Adh (alcohol dehydrogenase) sous le contrôle de séquences régulatrices du gène white, sont insérées dans le génome de la mouche, l’expression du gène endogène Adh (normalement non répété dans le génome) et du gène Adh transgénique est réprimée [ 4]. Cette extinction est d’autant plus forte que le nombre de copies du transgène w-Adh augmente. L’efficacité de cette régulation est affectée chez les individus portant à l’état hétérozygote des mutations dans les gènes Polycomb ou polycomblike, deux membres du groupe Polycomb. On observe, sur les chromosomes polytènes, que les protéines codées par ces deux gènes sont liées aux sites où sont insérés les transgènes éteints [4].

L’injection d’ADN chez C. elegans conduit à la formation de molécules extrachromosomiques composées de plusieurs centaines de copies de la séquence injectée répétées en tandem [ 5]. L’expression des séquences portées par les molécules extrachromosomiques est, en général, éteinte dans la lignée germinale, alors qu’elle ne l’est que rarement dans le soma. Les modifications des histones au niveau de ces molécules extrachromosomiques éteintes ont été étudiées par des expériences d’immunochimie [ 6]. Ces molécules fixent des anticorps capables de reconnaître spécifiquement la forme de l’histone H3 méthylée en position lysine 9.

L’extinction des transgènes semble donc avoir une composante transcriptionnelle, comme le confirme l’identification d’un certain nombre de gènes impliqués dans ce mécanisme. Ainsi, par analogie avec ce qui est connu chez D. melanogaster, le rôle de HP1 dans l’extinction des transgènes a été étudié. Après inactivation du gène codant pour cette protéine, les séquences présentes dans les molécules extra-chromosomiques sont exprimées. HP1 est donc nécessaire à l’extinction des transgènes [ 7]. Cette répression est aussi dépendante de gènes appelés mes-2 et mes-6, qui appartiennent au groupe Polycomb [ 8].

Chez C. elegans, les éléments transposables peuvent s’amplifier dans le soma, mais pas dans la lignée germinale [ 9, 10]. Cette observation suggère fortement qu’une régulation existe, maintenant le nombre de leurs copies à un niveau réduit dans la lignée germinale. Certains gènes impliqués dans cette régulation ont été identifiés par mutagenèse [ 11]. Ils peuvent être classés en deux catégories : ceux qui ne sont impliqués que dans la régulation des éléments transposables, et ceux qui sont également impliqués dans l’extinction des transgènes [ 12, 13] et dans un phénomène de régulation de l’expression des gènes connu sous le nom d’interférence par l’ARN (voir Encadré).

Chez C. elegans, la caractérisation du mécanisme de l’ARNi a permis de commencer à comprendre comment les éléments transposables sont contrôlés. Ainsi, des ARN double brin et des ARN guides correspondant aux séquences des éléments transposables ont été mis en évidence dans les souches de C. elegans chez lesquelles les éléments transposables sont régulés dans la lignée germinale [ 21].

Les ARN double brin caractérisés correspondent pour l’essentiel à des séquences longues d’une dizaine de paires de bases localisées aux extrémités des éléments transposables. Lorsque ces séquences sont insérées dans un transgène s’exprimant normalement dans la lignée germinale, l’expression de ce transgène est éteinte. Cette extinction est dépendante des gènes impliqués dans le contrôle des éléments transposables, ce qui suggère que les ARN double brin identifiés sont effectivement actifs dans le mécanisme de ce contrôle.

L’expression des séquences Stellate (Ste), naturellement répétées dans le génome de D. melanogaster, semble régulée par un mécanisme semblable à l’ARNi [ 22, 23]. Le locus Ste, localisé sur le chromosome X, est composé de la répétition en tandem d’un cadre ouvert de lecture dont le nombre de copies varie, selon les souches, de quelques unités à plus d’une centaine. L’expression de Ste est réprimée par Su(Ste), un locus indépendant localisé sur le chromosome Y et composé de répétitions en tandem très fortement apparentées à celles composant Ste. La délétion de ce locus se traduit par une stérilité des mâles associée à une surexpression de Ste. Des études successives ont permis de montrer que : (1) les gènes sting/aubergine, spindle-E/homeless et armitage (Tableau 1) impliqués dans l’ARNi sont également nécessaires au contrôle de Ste par Su(Ste) [22, 24] ; (2) les répétitions Su(Ste) produisent deux types de molécules d’ARN simple brin complémentaires, susceptibles de s’associer pour former une molécule double brin (Figure 2) ; (3) l’extinction de Ste s’accompagne, dans les testicules, de la production de molécules d’ARN dont la taille varie entre 25 et 27 nucléotides, et qui sont complémentaires de régions communes à Ste et Su(Ste). La relation entre production de molécules d’ARN double brin de Su(Ste) et extinction de Ste a été établie en utilisant un système cellulaire. Lorsque des cellules porteuses des répétitions Ste fusionnées avec un gène rapporteur sont transfectées avec une molécule d’ARN double brin du type de celle produite par Su(Ste), l’expression du gène rapporteur est supprimée.

Chez D. melanogaster, des mécanismes similaires à l’ARNi pourraient également intervenir dans le contrôle des éléments transposables. Ainsi, la recherche systématique d’ARN guides dans des embryons de D. melanogaster a montré qu’un grand nombre d’entre eux correspondent à des éléments transposables [ 25]. De plus, en contexte mutant pour spindle-E/homeless, l’expression d’un certain nombre d’éléments transposables est augmentée [23].

« Oui » et « Non » indiquent que le gène est impliqué ou non dans le phénomène considéré (ARNi, extinction des transgènes (TG), contrôle des séquences répétées (R), contrôle des éléments transposables (ET)). « ? » signifie que l’implication du gène dans le phénomène considéré n’a pas été étudiée. Les protéines concernées respectivement dans le quelling (quel) chez Neurospora crassa (Nc) et la co-suppression (Co-sup) chez Arabidopsis thaliana (At), deux processus de contrôle de l’expression des séquences répétées, sont indiquées. Les protéines participant au complexe RISC (voir Figure 2) sont indiquées par une astérisque. Spindle-E est aussi connue sous le nom de Homeless, et Aubergine sous le nom de Sting. Plusieurs types de ribonucléase semblent intervenir dans les mécanismes d’extinction des gènes. Comme les membres de la famille Dicer (voir texte), les nucléases Tudor-SN ont été conservées au cours de l’évolution. Il s’agit de composants du complexe RISC. Elles pourraient intervenir dans la dégradation de l’ARNm ciblé [ 34]. MUT-7 est une ribonucléase potentielle, identifiée exclusivement chez C. elegans [11], qui pourrait intervenir dans la stabilisation des ARN guides primaires [ 35]. RDE-4 et R2D2 possèdent des motifs de fixation à l’ARN double brin et interagissent avec Dicer. Elles pourraient jouer un rôle dans le transfert des ARN guides primaires de l’enzyme Dicer au complexe RISC. Les membres de la famille Argonaute sont largement impliqués dans les mécanismes d’extinction des gènes. Leur(s) rôle(s) est (sont) encore mal défini(s) mais RDE-1 semble nécessaire à la stabilisation des ARN guides primaires chez C. elegans [35]. Cette protéine peut se fixer à RDE-4 [ 36]. Chez D. melanogaster, Argonaute-1 (AGO-1) agit en aval de Dicer [ 37] et Argonaute-2 (AGO-2) est associée aux ARN guides [ 38] au sein du complexe RISC. Des mutants du gène aubergine sont défectifs pour l’ARNi [ 39] et piwi est impliqué dans le contrôle des séquences répétées et des éléments transposables [ 40, 41]. Des hélicases ARN putatives sont également impliquées dans l’ARNi. Chez C. elegans, mut-14 code pour une hélicase ARN potentielle [35], qui pourrait être nécessaire à l’initiation de la transcription inverse à l’origine de la formation de l’ARN double brin. DHR-1 est une autre hélicase ARN putative de C. elegans interagissant avec RDE-4 [36]. L’hélicase ARN Dmp68 de D. melanogaster est requise dans le mécanisme de l’ARNi [ 42]. Enfin, chez D. melanogaster, Armitage, qui est impliquée dans l’ARNi et le contrôle des séquences répétées [ 43], semble nécessaire à la formation d’un complexe RISC actif [24]. Cette protéine est très proche de SDE-3 présente chez Arabidopsis thaliana où elle joue un rôle dans la co-suppression. Chez D. melanogaster, VIG (vasa intronic gene) et dFXR, semblable à une protéine humaine dont l’expression est affectée chez les patients souffrant du syndrome de l’X fragile [ 44], font partie du complexe RISC. Dicer, AGO-2 et Dmp68 interagissent in vivo avec dFXR. Chez C. elegans, seule VIG a été identifiée. EGO-1 et RRF-1 sont deux protéines ressemblant à des ARN polymérases dépendantes de l’ARN [16] reconnues chez C. elegans mais absentes chez D. melanogaster. On pense qu’elles utilisent l’ARNm comme matrice pour synthétiser une molécule d’ARN double brin qui sera dégradée en ARN guides secondaires. En accord avec cette hypothèse, aucun ARN guide secondaire n’a pu être détecté dans des mutants de RRF-1.