L’épissage des pré-ARN messagers concerne au moins 95 % des transcrits et constitue un préalable à l’exportation des messagers matures dans le cytoplasme, siège de la synthèse protéique. Il s’effectue de façon coordonnée avec la transcription et se déroule en deux étapes successives impliquant deux réactions de transestérification. Trois déterminants de séquence sont requis (Figure 1A) : les sites d’épissage 5’ (site donneur) et 3’ (site accepteur) situés aux jonctions exon-intron, respectivement en 5’ et 3’ de l’intron, et le site de branchement en amont du site 3’ accepteur. Cette réaction (Figure 1B) a lieu au sein du splicéosome, un complexe dont l’assemblage et le fonctionnement requièrent plus de 150 polypeptides et cinq ribonucléoprotéines, les snRNP (small nuclear ribonucleoproteins), constituées d’une molécule d’ARN, l’ARNsn (snRNA), complexée avec sept protéines Sm ou apparentées et quelques autres protéines spécifiques [ 1]. Le splicéosome a deux fonctions : la reconnaissance des sites d’épissage et les étapes couplées d’élimination des introns et de re-ligation des exons. Plusieurs familles de protéines jouent un rôle majeur parmi lesquelles les protéines SR (riches en sérines et en arginines), hnRNP (heterogenous nuclear ribonucleoproteins) et CELF (CUG-binding protein and embryonic lethal abnormal vision-type RNA-binding protein 3-like factors) [ 2] (Figure 2). Un répertoire de séquences cis joue également un rôle déterminant lors de l’épissage [ 3] (Figure 2).

Figure 1. Épissage des pré-ARN messagers. A. Profil des séquences consensus au site d’épissage 5’, au site de branchement et au site d’épissage 3’. À chaque position, la fréquence des 4 nucléotides A, C, G et T est représentée par la taille des caractères. La fréquence a été déterminée à partir de 1 683 séquences humaines [ 44]. Les séquences les plus conservées sont les dinucléotides GU et AG, respectivement en 5’ et en 3’ de l’intron, et le nucléotide A au niveau du site de branchement. Les rectangles représentent les exons, et les traits pleins les introns. (Py)n : étendue de polypyrimidines. B. Réaction d’excision-épissage d’un pré-ARNm. L’épissage d’ARN prémessager se déroule en deux étapes successives, impliquant chacune une réaction de trans-estérification. Trois éléments sont essentiels à ces réactions : les sites d’épissage 5’ (ou site donneur) et 3’ (ou site accepteur), situés à la jonction exon-intron, respectivement en 5’ et 3’ de l’intron, et le site de branchement, en amont du site 3’ accepteur. Lors de la première étape, le groupement 2’ hydroxyle de l’adénosine du site de branchement attaque le phosphate du site d’épissage 5’. Cette réaction engendre un exon 5’ libre et un lariat intermédiaire. Lors de la deuxième étape, le 3’ hydroxyle de l’exon 5’ attaque le phosphate du site d’épissage 3’, produisant ainsi l’ARNm et le lariat d’intron.

Figure 1. Épissage des pré-ARN messagers. A. Profil des séquences consensus au site d’épissage 5’, au site de branchement et au site d’épissage 3’. À chaque position, la fréquence des 4 nucléotides A, C, G et T est représentée par la taille des caractères. La fréquence a été déterminée à partir de 1 683 séquences humaines [ 44]. Les séquences les plus conservées sont les dinucléotides GU et AG, respectivement en 5’ et en 3’ de l’intron, et le nucléotide A au niveau du site de branchement. Les rectangles représentent les exons, et les traits pleins les introns. (Py)n : étendue de polypyrimidines. B. Réaction d’excision-épissage d’un pré-ARNm. L’épissage d’ARN prémessager se déroule en deux étapes successives, impliquant chacune une réaction de trans-estérification. Trois éléments sont essentiels à ces réactions : les sites d’épissage 5’ (ou site donneur) et 3’ (ou site accepteur), situés à la jonction exon-intron, respectivement en 5’ et 3’ de l’intron, et le site de branchement, en amont du site 3’ accepteur. Lors de la première étape, le groupement 2’ hydroxyle de l’adénosine du site de branchement attaque le phosphate du site d’épissage 5’. Cette réaction engendre un exon 5’ libre et un lariat intermédiaire. Lors de la deuxième étape, le 3’ hydroxyle de l’exon 5’ attaque le phosphate du site d’épissage 3’, produisant ainsi l’ARNm et le lariat d’intron.

Figure 2. Schéma positionnant les principales protéines sur le pré-ARNm, ainsi que les séquences en cis les plus déterminantes pour la réaction d’épissage. La fonction des protéines SR (serine-rich) (représentées en orange) peut être réglée au niveau transcriptionnel, en fonction du tissu ou du stade de développement, par épissage alternatif, par phosphorylation-déphosphorylation, ce qui influence leur localisation subcellulaire et leur activité [ 45]. Elles sont stockées dans des compartiments du noyau appelés speckles ou SFC (splicing factors compartments) [ 46]. Elles doivent être recrutées par le complexe d’épissage et dirigées à la périphérie des SFC vers les sites de transcription. Une fois engagées dans le splicéosome, elles sont les cibles de phosphatases Ser/Thr, PP1, PP2A, PP2Cγ, dont certaines font partie intégrante du splicéosome [ 47]. Les protéines hnRNP (heterogeneous nuclear ribonucleoproteins) (représentées en jaune) figurent parmi les protéines les plus abondantes du noyau ; certaines d’entre elles sont confinées dans le nucléoplasme (hnRNP C et U), tandis que d’autres (hnRNP A, B, K, J) font la navette entre le noyau et le cytoplasme [ 48]. L’ESE (exonic splicing enhancer) (représenté en violet au niveau de l’exon) est le siège de nombreuses mutations qui modifient le site de liaison de protéines SR et conduisent à l’exclusion d’exon. Dans le cas de la myopathie de Becker, la mutation non-sens Glu1211X, touchant un ESE, conduit à une manifestation morbide modérée, tandis que la plupart des autres mutations non-sens entraînent la production de protéines tronquées, à l’origine d’un phénotype très sévère. Un algorithme de prédiction d’ESE fonctionnels est disponible en ligne (http://exon.cshl.edu/ESE/index.html). L’ESS (exonic splicing silencer) (représenté en vert au niveau de l’exon) agit, entres autres, par liaison à hnRNP I (ou PTB) et hnRNP A/B ou H. HnRNP A1 peut également induire la répression par liaison à un site exonique et par le recrutement coopératif d’autres hnRNP, ce qui neutralise l’activité d’enhancers proximaux, voire l’assemblage du splicéosome. L’ISE (intronic splicing enhancer) et l’ISS (intronic splicing silencer) (représentés respectivement en violet ou en vert au niveau de l’intron) auraient des rôles antagonistes, lesquels peuvent s’exercer au sein d’éléments introniques bipartites.

Figure 2. Schéma positionnant les principales protéines sur le pré-ARNm, ainsi que les séquences en cis les plus déterminantes pour la réaction d’épissage. La fonction des protéines SR (serine-rich) (représentées en orange) peut être réglée au niveau transcriptionnel, en fonction du tissu ou du stade de développement, par épissage alternatif, par phosphorylation-déphosphorylation, ce qui influence leur localisation subcellulaire et leur activité [ 45]. Elles sont stockées dans des compartiments du noyau appelés speckles ou SFC (splicing factors compartments) [ 46]. Elles doivent être recrutées par le complexe d’épissage et dirigées à la périphérie des SFC vers les sites de transcription. Une fois engagées dans le splicéosome, elles sont les cibles de phosphatases Ser/Thr, PP1, PP2A, PP2Cγ, dont certaines font partie intégrante du splicéosome [ 47]. Les protéines hnRNP (heterogeneous nuclear ribonucleoproteins) (représentées en jaune) figurent parmi les protéines les plus abondantes du noyau ; certaines d’entre elles sont confinées dans le nucléoplasme (hnRNP C et U), tandis que d’autres (hnRNP A, B, K, J) font la navette entre le noyau et le cytoplasme [ 48]. L’ESE (exonic splicing enhancer) (représenté en violet au niveau de l’exon) est le siège de nombreuses mutations qui modifient le site de liaison de protéines SR et conduisent à l’exclusion d’exon. Dans le cas de la myopathie de Becker, la mutation non-sens Glu1211X, touchant un ESE, conduit à une manifestation morbide modérée, tandis que la plupart des autres mutations non-sens entraînent la production de protéines tronquées, à l’origine d’un phénotype très sévère. Un algorithme de prédiction d’ESE fonctionnels est disponible en ligne (http://exon.cshl.edu/ESE/index.html). L’ESS (exonic splicing silencer) (représenté en vert au niveau de l’exon) agit, entres autres, par liaison à hnRNP I (ou PTB) et hnRNP A/B ou H. HnRNP A1 peut également induire la répression par liaison à un site exonique et par le recrutement coopératif d’autres hnRNP, ce qui neutralise l’activité d’enhancers proximaux, voire l’assemblage du splicéosome. L’ISE (intronic splicing enhancer) et l’ISS (intronic splicing silencer) (représentés respectivement en violet ou en vert au niveau de l’intron) auraient des rôles antagonistes, lesquels peuvent s’exercer au sein d’éléments introniques bipartites.

En 2004, environ 9,5 % des mutations répertoriées dans HGMD (human gene mutation database) affecteraient l’épissage (http://archive.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/ docs/hohoho.html). Les mutations de type I couvrent environ 60 % des mutations et touchent des séquences de sites d’épissage invariantes, ce qui abolit complètement la phase de définition de l’exon [ 4]. Les mutations de type II touchent les motifs variables. Dans le cas de la maladie de Menkes (défaut d’absorption hépatique du cuivre), une mutation d’un motif invariant du site donneur de l’exon 6 conduit à une forme très sévère, tandis qu’une délétion de 3 paires de bases (pb) du motif variable du même site donneur d’épissage conduit à une exclusion de l’exon 6 dans une fraction des transcrits et est associée à une forme moins agressive. Une mutation unique dans le dernier nucléotide de l’exon 18 du gène CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), associée à la mucoviscidose, crée un site cryptique conduisant à l’inclusion d’un nouvel exon de 84 pb. Le niveau de sévérité des atteintes pulmonaire et de l’épididyme est corrélé au taux d’inclusion de cet exon aberrant.

On estime que 10 000 à 20 000 des gènes humains sont sujets à un épissage alternatif (EA) [ 5, 6]. L’analyse de représentativité de fragments de transcrits au sein des banques d’EST (expressed sequence tags) montre, en effet, que chaque ARN prémessager peut faire l’objet, en moyenne, de six à huit épissages distincts, et cela pour l’ensemble des eucaryotes analysés. En outre, une analyse, avec les banques d’EST, de 475 séquences protéiques variantes retrouvées chez des sujets porteurs de maladies suggère qu’au moins un tiers de ces protéines est issu d’un épissage alternatif [ 7]. Des données récentes indiquent que 70 % à 88 % des événements d’EA changeraient la nature de la protéine, et seulement 19 % conduiraient à la production de protéines tronquées [ 8]. Cette dernière observation résulte en grande partie du fait que l’EA est souvent associé à l’insertion de codons stop prématurés (situés en amont de la position occupée par le codon stop habituellement utilisé), ce qui peut être à l’origine de la production de protéines tronquées, mais surtout du mécanisme de nonsense-mediated mRNA decay [ 9]. Ce mécanisme est en effet très souvent observé si le codon stop est situé à plus de 50-55 nucléotides en amont de la dernière jonction exon-exon, et conduit à diminuer considérablement la stabilité des transcrits correspondants, donnant ainsi rarement lieu à la synthèse d’une protéine abondante. Ce mécanisme souffre de peu d’exceptions et est interprété comme une surveillance physiologique destinée à prévenir la production de protéines tronquées potentiellement délétères. Enfin, l’épissage alternatif peut être influencé par la transcription [ 10, 11]. Les différents types d’EA sont illustrés sur la Figure 3.

Figure 3. Représentation des différents types d’épissage alternatif. En bleu les exons constitutifs, en violet les exons alternatifs, et en traits pleins les introns. Différentes combinaisons d’assemblage des exons, voire de rétention d’intron sont possibles. En outre, l’utilisation de promoteurs transcriptionnels peut dicter les choix d’épissage. Enfin, l’épissage alternatif peut conduire à l’utilisation de signaux de sites de polyadénylation distincts.

Figure 3. Représentation des différents types d’épissage alternatif. En bleu les exons constitutifs, en violet les exons alternatifs, et en traits pleins les introns. Différentes combinaisons d’assemblage des exons, voire de rétention d’intron sont possibles. En outre, l’utilisation de promoteurs transcriptionnels peut dicter les choix d’épissage. Enfin, l’épissage alternatif peut conduire à l’utilisation de signaux de sites de polyadénylation distincts.

L’analyse de maladies d’origine génétique a été longtemps focalisée sur la recherche de mutations affectant la région codante des protéines. Plus récemment, un très large ensemble de mutations régulatrices a été répertorié. Ces mutations sont associées à la production de transcrits moins abondants, aberrants ou nouveaux, codant ou non pour des protéines normales ou modifiées. La majorité des mutations morbides touchent davantage les séquences de régulation que les régions codantes [2, 12, 13] et affectent également des protéines d’épissage [ 14] (Tableaux I et II).

Tableau I. Exemples de gènes portant des mutations d’épissage associées à des maladies chez l’homme (adapté  de [13]). * OMIM : online Mendelian inheritance in man (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi ?db=OMIM).

Tableau I. Exemples de gènes portant des mutations d’épissage associées à des maladies chez l’homme (adapté  de [13]). * OMIM : online Mendelian inheritance in man (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi ?db=OMIM).

Tableau II. Exemples de gènes de protéines d’épissage impliquées dans des maladies chez l’homme (adapté de [14]).

Tableau II. Exemples de gènes de protéines d’épissage impliquées dans des maladies chez l’homme (adapté de [14]).

Une étape déterminante dans la compréhension des mécanismes et du rôle de l’EA tient à l’identification, in extenso, des événements d’épissage. Des algorithmes spécifiques ont été développés et plusieurs approches expérimentales à haut débit ont été explorées (Figure 4). L’utilisation de sondes oligonucléotidiques fixées sur des filtres de forte densité a permis l’hybridation d’ARNm à des taux reflétant la spécificité tissulaire d’expression des gènes cibles [ 15]. Des méthodes plus sophistiquées utilisant des fibres optiques ont également été proposées [ 16]. D’autres méthodes destinées à identifier l’ensemble des transcrits alternatifs d’un gène donné ont été également rapportées [ 17, 18]. Un ensemble de sites web dédiés à l’EA est listé par L.F. Larreau et al. [ 19].

Figure 4. Identification des événements d’épissage alternatif. A. Utilisation de sondes oligonucléotidiques fixées sur des filtres à forte densité. Dans cet exemple, le pré-ARNm contient 4 exons, dont un exon alternatif (E2 en violet). Cinq types de sondes sont utilisées : 1, 2, 3, 1-2, 1-3 (par exemple, la sonde 1 s’hybride au niveau de l’exon 1, la sonde 1-2 s’hybride au niveau de la jonction entre exon 1 et exon 2…). Les sondes oligonucléotidiques sont fixées sur des filtres par leur région 3’ (symbolisée par un rond noir). Les ARN ou les produits de RT-PCR marqués sont ensuite hybridés sur ces filtres. L’ARN qui contient les exons 1, 2 et 3 s’est hybridé avec les sondes 1, 2, 3, et 1-2, tandis que l’ARN ne contenant pas l’exon 2 s’est hybridé avec les sondes 1, 3, et 1-3. L’hybridation est représentée par le petit ovale jaune. B. Hybridation moléculaire. À partir d’ADN génomique, une série de sondes (flèches vertes) est produite. Elles sont ensuite hybridées avec des populations d’ARNm ou d’ADN complémentaire. L’hybridation n’a lieu qu’avec les séquences exoniques (adapté de [15]).

Figure 4. Identification des événements d’épissage alternatif. A. Utilisation de sondes oligonucléotidiques fixées sur des filtres à forte densité. Dans cet exemple, le pré-ARNm contient 4 exons, dont un exon alternatif (E2 en violet). Cinq types de sondes sont utilisées : 1, 2, 3, 1-2, 1-3 (par exemple, la sonde 1 s’hybride au niveau de l’exon 1, la sonde 1-2 s’hybride au niveau de la jonction entre exon 1 et exon 2…). Les sondes oligonucléotidiques sont fixées sur des filtres par leur région 3’ (symbolisée par un rond noir). Les ARN ou les produits de RT-PCR marqués sont ensuite hybridés sur ces filtres. L’ARN qui contient les exons 1, 2 et 3 s’est hybridé avec les sondes 1, 2, 3, et 1-2, tandis que l’ARN ne contenant pas l’exon 2 s’est hybridé avec les sondes 1, 3, et 1-3. L’hybridation est représentée par le petit ovale jaune. B. Hybridation moléculaire. À partir d’ADN génomique, une série de sondes (flèches vertes) est produite. Elles sont ensuite hybridées avec des populations d’ARNm ou d’ADN complémentaire. L’hybridation n’a lieu qu’avec les séquences exoniques (adapté de [15]).

La meilleure compréhension des mécanismes de l’EA et l’identification des transcrits qu’il produit ont permis de développer des stratégies visant à modifier le taux de transcrits alternatifs, pour favoriser la synthèse de protéines « thérapeutiques » ou bloquer la production de protéines « indésirables » [14, 24].

Blocage ou facilitation d’épissage avec des oligonucléotides

Des oligonucléotides destinés à inhiber l’inclusion de l’exon 23 muté du gène de la dystrophine dans le modèle murin des souris mdx (porteuses d’une mutation non-sens dans l’exon 23 du gène de la dystrophine, aboutissant à une protéine tronquée qui ne peut se localiser correctement au niveau du sarcolemme des fibres musculaires) permettent la synthèse et la localisation correctes de la dystrophine [ 35]. Récemment, une restauration phénotypique complète de fonction de la dystrophine a été obtenue chez ces souris, après injection de virus AAV (adeno-associated virus), permettant la production d’un transcrit élaboré de façon à induire l’exclusion de l’exon 23 porteur de la mutation et correspondant à une région répliquée non essentielle à la fonction de la protéine [ 36]. Des oligonucléotides antisens bifonctionnels, couvrant un domaine de ciblage couplé à une partie peptidique (PNA) contenant des ESE constituées de répétitions arginine-sérine, ont été utilisés [ 37, 38]. Le ciblage des transcrits BRCA1 et SMN2 par la méthode ESSENCE (exon-specific splicing enhancement by small chimeric effectors) a été réalisé avec succès [38]. Une variante de cette méthode, TOES (targeted oligonucleotide enhancer of splicing), consistant en l’inclusion d’un domaine effecteur contenant une séquence cible de fixation de protéines d’épissage comme ASF/SF2, a permis le traitement de fibroblastes de patients SMA, avec un degré de correction (inclusion de l’exon 7 du gène SMN2) de l’ordre de 70 % [14]. Une approche similaire a été réalisée avec un oligonucléotide bifonctionnel capable de recruter la protéine hnRNPA1 et d’augmenter le rapport transcrits Bcl-xS/transcrits Bcl-xL, dans le but de promouvoir le potentiel pro-apoptotique [ 39] (Figure 5). L’interférence par l’ARN s’est également montrée efficace [ 40].

Figure 5. Blocage ou facilitation d’épissage avec des oligonucléotides dirigés contre des motifs d’épissage Les oligonucléotides antisens sont représentés en vert. Ils permettent l’exclusion d’un exon (A), bloquent les sites cryptiques d’épissage 5’ ou 3’ aberrants (B), forcent la sélection d’un site d’épissage 5’ particulier (C). En bleu les exons constitutifs, en violet les exons alternatifs, en traits pleins les introns (exemples des gènes β-globine et CFTR [ 49], du gène DMD [ 50] et du gène Bcl-X [ 51]) (adapté de [49]).

Figure 5. Blocage ou facilitation d’épissage avec des oligonucléotides dirigés contre des motifs d’épissage Les oligonucléotides antisens sont représentés en vert. Ils permettent l’exclusion d’un exon (A), bloquent les sites cryptiques d’épissage 5’ ou 3’ aberrants (B), forcent la sélection d’un site d’épissage 5’ particulier (C). En bleu les exons constitutifs, en violet les exons alternatifs, en traits pleins les introns (exemples des gènes β-globine et CFTR [ 49], du gène DMD [ 50] et du gène Bcl-X [ 51]) (adapté de [49]).

Le trans-épissage

Cette approche, appelée SMART (spliceosome-mediated RNA transsplicing), repose sur le ciblage des pré-ARNm [14] (Figure 6). Elle a permis la correction du saignement, associé à la production de facteur VIII, dans un modèle de souris hémophiles [ 41]. Le trans-épissage a été également utilisé pour cibler des transcrits matures avec des ribozymes de groupe I [ 42]. Une troisième approche repose sur l’utilisation d’une endonucléase d’épissage des ARNt. L’endonucléase permet le clivage de l’ARN cible et de l’ARN correcteur apporté, avant que les étapes de cis- et de trans-épissage ne se déroulent. L’expression de l’endonucléase et de la séquence de ciblage a permis de reprogrammer un gène cellulaire dans des fibroblastes de souris [ 43].

Figure 6. Le trans-épissage. Dans cet exemple, le pré-ARNm comprend deux exons, et porte une mutation (représentée en violet) dans le deuxième exon, conduisant à une protéine non fonctionnelle. L’utilisation de PTM (pre-trans-splicing molecule) permet la suppression de la mutation en remplaçant l’exon muté. Le PTM se lie au pré-ARNm par appariement de séquences, ce qui masque en partie le site 3’ d’épissage. La réaction d’épissage normale est donc bloquée et le domaine de trans-épissage du PTM peut jouer le rôle d’un site 3’ d’épissage. Le PTM apporte l’exon dépourvu de mutation, ce qui permet la réparation de l’ARNm et la production d’une protéine fonctionnelle. (Py)n : étendue de polypyrimidines, SB : site de branchement.

Figure 6. Le trans-épissage. Dans cet exemple, le pré-ARNm comprend deux exons, et porte une mutation (représentée en violet) dans le deuxième exon, conduisant à une protéine non fonctionnelle. L’utilisation de PTM (pre-trans-splicing molecule) permet la suppression de la mutation en remplaçant l’exon muté. Le PTM se lie au pré-ARNm par appariement de séquences, ce qui masque en partie le site 3’ d’épissage. La réaction d’épissage normale est donc bloquée et le domaine de trans-épissage du PTM peut jouer le rôle d’un site 3’ d’épissage. Le PTM apporte l’exon dépourvu de mutation, ce qui permet la réparation de l’ARNm et la production d’une protéine fonctionnelle. (Py)n : étendue de polypyrimidines, SB : site de branchement.

À la lumière de ces différentes approches, il est concevable d’imaginer des combinaisons entre ces stratégies : par exemple, le cumul d’agents pharmacologiques agissant sur le taux ou l’activité des protéines SR et topo-isomérases avec des expériences de trans-épissage. La sélection forcée de promoteurs transcriptionnels, par l’utilisation de ligands de récepteurs nucléaires, pourrait également constituer une approche prometteuse permettant de diriger des épissages alternatifs spécifiques [34].

Outre l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles, la recherche systématique des événements d’EA pourrait permettre d’obtenir des canevas de référence quant au caractère prédictif potentiel, par exemple, d’un état précancéreux, ou de l’efficacité d’un traitement. Les possibilités nouvelles évoquées par les succès expérimentaux récents de compensation fonctionnelle suscitent de réels espoirs thérapeutiques. Les difficultés prévisibles appartiennent au registre des étapes requises pour le développement de médicaments. À celles-ci, s’ajoutent les obstacles inhérents aux approches de thérapie génique et cellulaire en termes d’efficacité, de « durabilité », et surtout d’innocuité à long terme. De plus, les « niches » constituées par les maladies génétiques rares risquent de représenter une priorité toute relative pour l’industrie pharmaceutique. En revanche, tous les intervenants en santé humaine seront sans aucun doute très motivés par le défi de l’élaboration de molécules à visée anticancéreuse. C’est probablement dans ce domaine que les attentes seront les plus nombreuses et les plus difficiles à satisfaire.

Nous remercions vivement le Dr Jamal Tazi (CNRS, Montpellier) pour sa lecture du manuscrit. Merci également pour leur soutien à l’Inserm, la Ligue Nationale contre le Cancer, la Ligue contre le Cancer de Saône-et-Loire et le Conseil régional de Bourgogne