L’extraction de substances naturelles constitue la source principale d’approvisionnement pour nombre de molécules pharmaceutiques. Dans la mesure où il est possible d’identifier les gènes codant pour une molécule, ceux-ci peuvent être introduits dans des cellules en culture qui deviennent alors autant d’usines cellulaires fabriquant le produit souhaité. Dans la dynamique créée par l’arrivée de nouveaux systèmes d’expression végétaux, les microalgues, organismes unicellulaires aquatiques, apportent des compléments stratégiques et devraient constituer à l’avenir un système performant de production de molécules recombinantes commerciales.

À ce jour, plusieurs systèmes d’expression de protéines recombinantes ont été développés, offrant chacun des avantages et des inconvénients. Pour l’expression de molécules simples, les bactéries suffisent ; c’est le cas, par exemple, de l’hormone de croissance, de l’insuline, des interférons α et β, de l’interleukine-1 et du TNF (tumor necrosis factor) [ 1]. Cependant, ces organismes ne peuvent pas assembler des molécules complexes ni assurer leur maturation via des modifications post-traductionnelles comme les glycosylations, l’isomérisation cis/trans des prolines, les modifications de lipidation ou de phosphorylation. La présence de corps d’inclusion qui rendent difficile la purification, et la production d’endotoxines complètent cette liste de défauts. En conséquence, la production de protéines recombinantes complexes requiert l’usage de systèmes d’expression eucaryotes [ 2].

Parmi les modifications post-traductionnelles, la N-glycosylation revêt une importance particulière car elle a un impact majeur sur la conformation, et par conséquent sur l’activité, des protéines thérapeutiques produites par transgenèse. Ce processus débute par le transfert d’un précurseur oligosaccharidique sur un résidu asparagine de la protéine néo-synthétisée, suivi d’une maturation dans le réticulum endoplasmique puis d’une étape de modification des N-glycanes par transfert de nouveaux résidus dans l’appareil de Golgi. Ces modifications golgiennes diffèrent entre cellules eucaryotes et il en résulte des différences structurales entre N-glycanes associés aux protéines matures. En conséquence, si tout système eucaryote est apte à introduire des N-glycanes indispensables à la mise en conformation des protéines, les différences de maturation de ceux-ci peuvent limiter ou interdire l’emploi en thérapie des molécules recombinantes, notamment en raison du risque de déclenchement d’une réponse immunitaire. Ainsi, les levures (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis et Hansenula polymorpha, [1]) introduisent sur leurs glycoprotéines des polymannoses de grande taille [ 3]. Le système d’expression en cellules d’insectes, via un Baculovirus, constitue un procédé attrayant de production de protéines par transgenèse. Les cultures croissent en suspension et la plupart des protéines surexprimées dans les cellules d’insectes restent solubles [1]. Cependant, la sialylation des glycoprotéines, étape ultime de la glycosylation, aboutit rarement. De même, la production dans des cellules animales (CHO, BHK et MML^1,) [1] se heurte également à des problèmes de sialylation terminale des N-glycanes [ 4]. Quel que soit le système considéré, plusieurs stratégies ont été développées pour corriger les différences observées de glycosylation entre protéines naturelles et recombinantes, soit par l’inactivation de gènes codant pour des enzymes introduisant les résidus immunogènes, soit par complémentation par des gènes codant des enzymes permettant de reconstruire les séquences glucidiques absentes dans ces organismes [ 5]. Les résultats les plus spectaculaires ont été obtenus par Gerngross et ses collaborateurs, au sein de la société GlycoFi (États-Unis), qui ont complètement « humanisé » la N-glycosylation chez la levure par la suppression de 4 gènes et l’ajout de 14 autres [ 6].

Les cellules végétales peuvent, quant à elles, procéder à un repliement et à l’assemblage de protéines recombinantes complexes, ainsi qu’au transfert et à la maturation de N-glycanes sur celles-ci. De plus, les organismes photosynthétiques offrent deux voies biologiques très différentes dans l’expression et la production de molécules recombinantes : une voie nucléaire et une voie chloroplastique (Tableau I). Les travaux pionniers de Hiatt avec la production d’anticorps fonctionnels exprimés dans du tabac transgénique, ont consacré le terme de Plantibodies (ou planticorps) [ 7]. De nombreuses autres molécules recombinantes actives, vaccins, anticorps monoclonaux, enzymes et hormones, ont été depuis produites avec succès [ 8]. Plusieurs plantes sont concernées, le tabac, le riz, le blé, la luzerne, le pois par exemple. Mais les cellules de plantes introduisent des épitopes glucidiques β1,2-xylose et α1,3-fucose immunogènes chez l’humain [ 9] nécessitant des interventions génétiques [ 10]. Les premières commercialisations de molécules issues de plantes génétiquement modifiées ont concerné l’avidine, produite dans le maïs en 1997, la β-glucuronidase en 1998 ou plus récemment, la trypsine. Le risque de dissémination de gènes dans le milieu naturel reste le principal écueil à l’essor de la production de molécules recombinantes chez les végétaux supérieurs, bien que les stratégies de transformation des chloroplastes (voir Encadré) tentent de répondre à cette question. À la grande variation des niveaux d’expression d’une plante à une autre s’ajoute l’instabilité de l’expression dans les feuilles, ce qui nécessite une extraction et une purification rapide avant d’éventuelles dégradations. De plus, la réaction du public vis-à-vis des plantes génétiquement modifiées demeure imprévisible. Pour pallier cet obstacle, la production de ces molécules recombinantes par des cellules végétales se fait en bioréacteurs confinés et sûrs. La détection des transgènes est rapide et l’expression des molécules recombinantes peut se faire dans le milieu de culture. Néanmoins, les rendements restent faibles et les effets mécaniques fragilisants.

Tableau I. Comparaison des deux voies d’expression : chloroplastique et nucléaire chez les plantes.

Tableau I. Comparaison des deux voies d’expression : chloroplastique et nucléaire chez les plantes.

Autre exemple de végétal, la mousse (Physcomytrella patens) transgénique. Des lignées transformées stables sont obtenues en 8 semaines et le biais de codon^2, serait plus proche de l’animal que des plantes dressées³. L’obstacle de l’immunogénicité induite par leur N-glycosylation a été contourné par l’extinction des gènes codant pour les enzymes responsables de l’ajout des épitopes glucidiques immunogènes (β1,2-xylose et α1,3-fucose). Ces travaux ont récemment abouti à l’expression d’érythropoïétine (EPO) humaine [ 11]. Autre exemple, la lentille d’eau Lemna (plante clonale utilisée par la société Biolex) possède un temps de génération court, un rendement élevé en protéines et un système d’excrétion permettant une production de protéines à faible coût. L’immunogénicité des N-glycanes a également pu être abolie chez cette plante [ 12].

Les microalgues vivent de facto en suspension. Des centaines de milliers d’espèces de microalgues sont réparties sur la surface du globe en milieu marin, dulçaquicole⁴ ou saumâtre (Figures 1-4). Elles ont colonisé les glaces polaires, les zones désertiques et les sources d’eau chaude. Elles vivent dans des marais salants, dans des milieux acides ou fortement alcalins. Elles jouent un rôle majeur dans le climat mondial comme machine à transformer le CO₂ en matière organique. Leur culture en photobioréacteurs confinés est maîtrisée, réduisant les risques de dissémination et de pollution génique. Elles procurent d’excellents rendements en biomasse et restent compétitives en coûts de production. Elles n’exigent pour leur développement que de l’eau (douce ou salée), des éléments nutritifs, du carbone et de la lumière. Le taux de division cellulaire rapide (de l’ordre du jour) permet d’atteindre des densités cellulaires élevées et de répondre rapidement à toute stratégie de recherche et développement. L’activité d’une nouvelle construction génétique transférée dans ces organismes peut être recherchée et mesurée un mois après la mise en culture, et un volume conséquent (300 litres) peut être atteint deux mois plus tard, représentant une biomasse très importante (1 à 3 grammes sec par litre).

Figure 1.

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Figure 2.

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Figure 3.

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Figure 4.

Figure 4.

La transformation génétique chez les microalgues a fait son apparition dans les années 1980. Les espèces phares sont alors Chlamydomonas reinhardtii, Dunaliella salina, Phaeodactylum tricornutum (voir Figures 1 à 4, p. 378 et 380) et Chorella vulgaris (Tableau II). Les perspectives et le potentiel des microalgues comme usines cellulaires ont été abordés et traités par différents auteurs, récemment et de façon plus ou moins exhaustive [ 13– 17]. L’algue verte unicellulaire Chlamydomonas reinhardtii s’est vite imposée comme système modèle [ 18]. Elle peut être cultivée de façon auto et hétérotrophe en utilisant de l’acétate comme source de carbone. Des séquences promotrices nucléaires et chloroplastiques ont été identifiées. Actuellement, C. reinhardtii n’est plus seulement un modèle d’étude fondamentale [18] mais est au cœur d’applications biotechnologiques avec la production de biohydrogène et la biorémédiation⁵ des sols pollués par des métaux lourds. Parmi les autres microalgues utilisées dans un cadre biotechnologique, citons l’expression transitoire de l’hormone de croissance humaine dans le milieu extracellulaire de Chlorella sp. Des soles alimentées avec Chlorella ellipsoidea, exprimant une hormone de croissance de sole, atteignent une taille de 25 % supérieure à celle de poissons témoins après 10 jours de culture. Par ailleurs, des tests antimicrobiens in vitro ont montré la grande efficacité d’expression par les cellules de chlorella, du peptide neutrophile 1 (NP-1), biologiquement actif. L’expression du gène VP1 du virus de la fièvre aphteuse chez Chlamydomonas reste le seul exemple de production de protéine vaccinale (Tableau III). En terme de production de protéines thérapeutiques, le résultat le plus marquant est à ce jour la production de large single chain (lsc) d’anticorps dans la microalgue Chamydomonas reinhardtii par l’équipe de S. Mayfield (Tableau III).

Tableau II. Microalgues transformées et méthodes utilisées.

Tableau II. Microalgues transformées et méthodes utilisées.

Tableau III. Principales molécules produites chez les microalgues.

Tableau III. Principales molécules produites chez les microalgues.

Les processus de N-glycosylation chez les microalgues n’ont pas à ce jour été explorés. Compte tenu de leur importance dans le cadre de la production de molécules recombinantes, nous avons entrepris une étude de ces processus chez plusieurs microalgues pressenties comme potentielles usines cellulaires. « L’ancestralité » de plusieurs groupes phylogénétiques de phytoplancton laisse espérer la conservation chez ces organismes des caractéristiques primitives des processus de glycosylation, en amont du point de divergence entre les plantes supérieures et les animaux. On pourrait ainsi éluder l’obligatoire et difficile « adaptation » des processus de glycosylation.

La composition en nucléotides varie grandement entre genres, et dans une moindre mesure entre espèces voire dans un même génome. À titre d’exemple, pour le génome nucléaire des diatomées, le pourcentage est proche de l’équilibre : 49,63 % chez Phaeodactylum tricornutum, Thalassiosira sp., alors que des algues de la lignée verte telle Chlorella vulgaris comptent 63,92 % de GC, proche des 63 % de Chlamydomonas reinhardtii. Les algues rouges, si l’on se réfère à Porphyridium cruentum (59,4 %) seront proches des algues vertes, les plantes terrestres étant en dessous de la barre moyenne puisque Arabidopsis thaliana présente un taux en GC de 44,60 % et le tabac 43,57 %. Cet équilibre revêt une importance particulière dans le cas de l’expression de protéines hétérologues d’origine humaine, puisque Homo sapiens privilégie un usage des nucléotides GC à 52,4 %. Il faut noter la relative homogénéité du taux de GC de tous les plastides quelles que soient les microalgues considérées avec pour Phaeodactylum sp. (33,69 %), Thalassiosira sp. (30,17 %), Chlorella vulgaris (34,63 %), Chlamydomonas reinhardtii (35,16 %), Dunaliella sp (32,62 %), Tetraselmis sp. (39,18 %), Porphyridium cruentum (36,51 %).

À l’exception de méthodes anecdotiques comme la transformation par billes de verre de Chlamydomonas reinhardtii, la transformation par des trichites de carbure de silicium (SiC) ou la transformation par Agrobacterium chez Chlamydomonas reinhardtii, l’électroporation (consistant à soumettre les cellules à un champ électrique pour former des pores) est l’une des premières méthodes mise en œuvre avec succès pour la transformation nucléaire de quatre espèces de microalgues, Chlamydomonas reinhardtii, Chlorella ellipsoidea, Chlorella vulgaris et Dunaliella salina. Le bombardement par microparticules ou biolistique utilise des microparticules inertes d’or ou de tungstène recouvertes d’ADN et propulsées à grande vitesse par un gaz comprimé. C’est la méthode utilisée pour Chlamydomonas, Chlorella et Volvox. Elle s’est aussi montrée particulièrement efficace pour la transformation de diatomées (Tableau II).

Dans la liste des promoteurs utilisés chez les microalgues, on trouve le très classique promoteur du gène 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur, utilisé avec succès chez Chlorella ellipsoidea [ 19]. A mentionner, le promoteur de nitrate reductase endogène, actif chez Chlamydomonas reinhardtii mais aussi chez la diatomée Cylindrotheca fusiformis. Dans la voie nucléaire, l’événement le plus courant est une recombinaison dite non homologue. Plusieurs techniques ont tenté de favoriser l’intégration en agrandissant la taille des vecteurs ou en incluant des marqueurs de sélection particuliers, mais dans la plupart des cas l’on observe que quelques intégrations aléatoires dans le génome (intégrations ectopiques). Des travaux déterminants sur ce sujet ont été publiés et une piste pourrait consister à identifier un site silencieux à l’exemple de Chlamydomonas reinhardtii. La transformation chloroplastique a été décrite pour la première fois chez l’algue unicellulaire Chlamydomonas reinhardtii. Les promoteurs provenant des gènes chloroplastiques tels rbcL (ribulose bisphosphate carboxylase/oxygènase sous-unité majeure) et atpA (subunité λ-ATP synthase) de Chlamydomonas reinhardtii sont les plus fréquents. Les gènes rapporteurs couramment utilisés pour les études d’expression des gènes dans le chloroplaste sont le gène gfp (green fluorescent protein, GFP), luxCt (Luciferase, LUC) et le gène uidA (GUS). Ces marqueurs fonctionnent dans d’autres groupes d’algues, comme par exemple la diatomée Phaeodactylum tricornutum. Une telle entreprise bénéficie grandement des avancées qu’offre la publication des données de séquençages complets des génomes. La liste s’étoffe et nous avons dorénavant accès aux génomes complets de Chlamydomonas reinardtii, Cyanidoschison merolae, Thalassiosira pseudonana, Ostreococcus taurii et Phaeodactylum tricornutum en cours d’annotation et à laquelle nos équipes participent.

L’industrie pharmaceutique et les sociétés de biotechnologie sont confrontées à un défi majeur : celui de disposer de systèmes de production de protéines recombinantes qui puissent répondre à leurs contraintes à la fois en terme de qualité, de quantité produite et de rentabilité. Il existe au niveau mondial un déficit de capacité de production de ces protéines recombinantes, car les systèmes actuellement disponibles ne permettent pas de produire en quantité suffisante des protéines de qualité pour un coût raisonnable. Ce besoin va s’accentuer dans les années à venir. Depuis la fin des années 1990, plus de 280 protéines recombinantes thérapeutiques, dont une vingtaine d’anticorps monoclonaux, sont commercialisées, représentant un chiffre d’affaires estimé à près de 49 milliards de dollars US en 2006. Ce domaine d’activité connaît une croissance de 20 % par an contre 7 % pour l’industrie pharmaceutique globale et près de 2200 nouvelles protéines recombinantes sont actuellement en phase clinique. L’idée de créer une structure de production de molécules recombinantes à haute valeur commerciale dans un système microalgue a déjà conduit à la création de deux sociétés aux États-Unis. La stratégie est tangible et son succès est exclusivement dépendant de choix judicieux en termes d’espèces de microalgues, de molécules exprimées et de ressource humaine.

Nous tenons à remercier les deux évaluateurs anonymes pour leur aide et critiques constructives