Dans cette revue, nous nous intéressons aux propriétés qui font des autoanticorps des biomarqueurs potentiels et décrivons les techniques qui permettent leur identification. Nous insistons ensuite plus particulièrement sur l’intérêt des signatures humorales en pratique clinique et enfin, nous discutons des défis futurs, notamment ceux qui concernent la validation de ces tests.

La détection des cancers aux premiers stades de la maladie est un des enjeux majeurs en cancérologie. Elle se justifie notamment par le fait que le risque de récidive locale ou à distance est bien plus faible lorsque le cancer est diagnostiqué précocement que lorsqu’on le décèle à un stade avancé [ 1]. Ceci est particulièrement important dans les populations de patients à haut risque de développer un cancer, l’incidence de la maladie y étant significativement plus élevée que dans la population générale. L’imagerie a depuis plusieurs années permis des avancées significatives dans l’aide au diagnostic. Des appareillages de plus en plus sensibles ont été développés, capables désormais de mettre en évidence des tumeurs inframillimétriques. Des efforts importants d’organisation ont aussi été accomplis pour assurer l’accès de la population générale à ces appareillages comme on le voit par exemple avec le dépistage organisé du cancer du sein en France [ 30] (→), ou encore avec la mise en place de réseaux nationaux de formation pour les utilisateurs. Malheureusement, le même constat ne peut être fait pour les marqueurs tumoraux sériques. En effet, la majorité d’entre eux ont été identifiés il y a maintenant plusieurs décennies et rares sont ceux dont la détection peut être proposée dans le cadre d’un dépistage ou d’un diagnostic précoce du cancer [ 2]. Leur utilisation est actuellement limitée, le plus souvent à l’établissement du bilan initial du cancer (valeur de référence), à l’évaluation de l’efficacité thérapeutique et à la surveillance d’une récidive.

(→) Voir l’article de Claire Julian-Reynier, page 657 de ce numéro

Une voie de recherche intéressante dans l’identification de nouveaux marqueurs sériques des formes précoces de cancers semble être l’étude de la réponse humorale. Ainsi, au cours de ces dernières années, un très grand nombre d’articles de recherche ont apporté la preuve de l’existence d’autoanticorps circulants dans le sérum de patients atteints de cancers [ 3]. Cette inflation littéraire s’explique notamment par l’importance des avancées technologiques réalisées ces dix dernières années.

Le répertoire d’autoanticorps liés aux tumeurs est généralement étudié par des techniques de protéomique [ 29]. Les deux techniques principales qui ont permis d’identifier un très grand nombre d’autoantigènes sont le SEREX (serological identification of antigens by recombinant expression cloning) et le SERPA (serological proteome analysis) (Figure 1A et B). Elles restent à ce titre les techniques de référence pour l’étude de la réponse humorale au développement d’un cancer. Cette analyse a largement profité des progrès technologiques réalisés ces dernières années dans la miniaturisation des outils. En effet, sur le même principe que celui des puces à ADN, des puces à protéines ont été développées (Figure 1C). Leur principe est basé sur l’immobilisation d’antigènes ou d’anticorps sur un support (lame) et sur une analyse différentielle des interactions autoantigène/autoanticorps. Ces puces à protéines ont facilité la découverte de nouveaux autoanticorps et des antigènes qui leur sont associés dans le sérum de patients atteints de cancer (pour revue, voir [3]).

Figure 1 Techniques de protéomique utilisées pour l’identification des autoantigènes tumoraux. A. Le criblage des autoantigènes exprimés par les tumeurs a d’abord été réalisé par la technique du SEREX [ 25, 26]. Une banque d’expression d’ADNc est construite à partir d’échantillons tumoraux et clonée dans des phages d’expression. Les phages recombinants sont ensuite transfectés dans des bactéries (E. coli). Les protéines recombinantes, exprimées durant l’infection des bactéries, sont transférées sur une membrane de nitrocellulose qui est ensuite incubée avec le sérum autologue du patient. Les clones réagissant avec les anticorps des patients (IgG) sont identifiés par un second anticorps conjugué à une enzyme. L’ADNc correspondant est ensuite séquencé. Le principal avantage du SEREX est qu’il permet l’exploration de la réponse humorale dans le sérum des patients avec leur propre tumeur comme source antigénique. B. La seconde technique, le SERPA, associe une séparation des protéines tumorales par électrophorèse bidimensionnelle (2-DE) en fonction de leur point isoélectrique (pI) et de leur poids moléculaire (PM). Les protéines sont transférées et immobilisées sur une membrane. Les sérums des patients atteints de cancer ou des contrôles sont criblés individuellement, permettant l’immunodétection d’antigènes spécifiques parmi plusieurs milliers de protéines séparées. Le marquage comparatif des blots permet la détection de spots réagissant spécifiquement avec les sérums de cancer. Ces spots sont ensuite excisés du gel et les protéines sont identifiées par spectrométrie de masse. Le SERPA permet l’identification d’isoformes et de modifications post-traductionnelles, mais est limité concernant l’identification de protéines de faible poids moléculaire ou de faible abondance, à cause de la sensibilité de détection. C. L’approche par puces regroupe 2 formats. Les puces à protéines (C) sont basées sur des centaines voire des milliers d’antigènes connus immobilisés sur une lame de verre. Les puces sont ensuite incubées avec des sérums de patients et de contrôles afin d’isoler les antigènes qui réagissent spécifiquement. En général, les protéines sont produites dans des systèmes procaryotes (E. coli), ce qui empêche l’identification de modifications post-traductionnelles. Les puces à capture inverse immobilisent non plus des protéines, mais des anticorps connus et spécifiques synthétisés pour lier les antigènes natifs contenus dans les extraits de tumeurs ou de lignées cellulaires. Les autoanticorps provenant de patients et de contrôles sont marqués avec différentes cyanines fluorescentes et, après incubation, le ratio de fluorescence détermine l’abondance relative des autoanticorps dans un échantillon donné. L’identification est directe grâce aux anticorps connus, et cette technique, contrairement aux puces à protéines, permet l’identification d’épitopes tumoraux naturels et de modifications post-traductionnelles.

Figure 1 Techniques de protéomique utilisées pour l’identification des autoantigènes tumoraux. A. Le criblage des autoantigènes exprimés par les tumeurs a d’abord été réalisé par la technique du SEREX [ 25, 26]. Une banque d’expression d’ADNc est construite à partir d’échantillons tumoraux et clonée dans des phages d’expression. Les phages recombinants sont ensuite transfectés dans des bactéries (E. coli). Les protéines recombinantes, exprimées durant l’infection des bactéries, sont transférées sur une membrane de nitrocellulose qui est ensuite incubée avec le sérum autologue du patient. Les clones réagissant avec les anticorps des patients (IgG) sont identifiés par un second anticorps conjugué à une enzyme. L’ADNc correspondant est ensuite séquencé. Le principal avantage du SEREX est qu’il permet l’exploration de la réponse humorale dans le sérum des patients avec leur propre tumeur comme source antigénique. B. La seconde technique, le SERPA, associe une séparation des protéines tumorales par électrophorèse bidimensionnelle (2-DE) en fonction de leur point isoélectrique (pI) et de leur poids moléculaire (PM). Les protéines sont transférées et immobilisées sur une membrane. Les sérums des patients atteints de cancer ou des contrôles sont criblés individuellement, permettant l’immunodétection d’antigènes spécifiques parmi plusieurs milliers de protéines séparées. Le marquage comparatif des blots permet la détection de spots réagissant spécifiquement avec les sérums de cancer. Ces spots sont ensuite excisés du gel et les protéines sont identifiées par spectrométrie de masse. Le SERPA permet l’identification d’isoformes et de modifications post-traductionnelles, mais est limité concernant l’identification de protéines de faible poids moléculaire ou de faible abondance, à cause de la sensibilité de détection. C. L’approche par puces regroupe 2 formats. Les puces à protéines (C) sont basées sur des centaines voire des milliers d’antigènes connus immobilisés sur une lame de verre. Les puces sont ensuite incubées avec des sérums de patients et de contrôles afin d’isoler les antigènes qui réagissent spécifiquement. En général, les protéines sont produites dans des systèmes procaryotes (E. coli), ce qui empêche l’identification de modifications post-traductionnelles. Les puces à capture inverse immobilisent non plus des protéines, mais des anticorps connus et spécifiques synthétisés pour lier les antigènes natifs contenus dans les extraits de tumeurs ou de lignées cellulaires. Les autoanticorps provenant de patients et de contrôles sont marqués avec différentes cyanines fluorescentes et, après incubation, le ratio de fluorescence détermine l’abondance relative des autoanticorps dans un échantillon donné. L’identification est directe grâce aux anticorps connus, et cette technique, contrairement aux puces à protéines, permet l’identification d’épitopes tumoraux naturels et de modifications post-traductionnelles.

Ils portent principalement sur l’identification des combinaisons d’antigènes les plus pertinentes possibles. Plusieurs points sont à prendre en considération. Premièrement, la source d’antigènes doit être la plus proche possible des conditions physiopathologiques à l’origine de la réponse humorale chez les individus atteints de cancers. Les extraits protéiques tumoraux sont probablement le meilleur choix, bien que la disponibilité de ces tissus soit en pratique très dépendante du type tumoral. À titre d’exemple, l’obtention d’échantillons de lésions pré-invasives est souvent de l’ordre de l’impossible du fait de la nécessité pour le pathologiste d’étudier la pièce opératoire dans son ensemble afin de s’assurer de l’absence d’invasion ou de micro-invasion. Ces conditions permettent également de conserver les protéines immunogènes avec leurs modifications post-traductionnelles (glycosylation, phosphorylation, sumoylation, etc.). L’amélioration des techniques de protéomique est également un des défis majeurs dans un avenir proche. Dans cet objectif, des techniques de séparation telles que la nanochromatographie liquide permettent aux protéines de relativement faible abondance d’être analysées. Enfin, il faudrait probablement utiliser les données de la littérature afin de proposer une combinaison de nouveaux marqueurs et de marqueurs existants. Dans une étude de premier ordre, Wang et ses collaborateurs [ 24] ont proposé de combiner un panel de 22 peptides immunogènes avec la détection du marqueur de référence, l’antigène spécifique de prostate (PSA). Cette signature permet d’obtenir une sensibilité significativement supérieure (93 %) à celle du PSA seul (80 %), améliorant ainsi sa valeur diagnostique. Ce panel pourrait être utilisé pour les patients qui présentent des taux sériques de PSA inférieurs ou égaux à 10 ng/ml, comme aide à la décision de pratiquer une biopsie.

La sensibilité et la spécificité des panels d’autoanticorps utilisés pour détecter précocement les cancers se sont significativement améliorées et ont ainsi apporté la preuve que la détection préclinique était réalisable dans les groupes à haut risque tels que les bronchitiques chroniques dans le cancer du poumon. Ces tests seraient alors proposés en complément des examens radiographiques standard afin de réduire la proportion des faux positifs. Dans d’autres types de cancers comme le cancer du sein, ces études sont entravées par le manque de disponibilité de sérums, de tumeurs à des stades précoces, et de cohortes pré-diagnostiques. À ce titre, l’analyse des populations porteuses de formes familiales de cancer (mutations de BRCA1-2) serait d’un grand intérêt. La disponibilité d’échantillons humains est donc un facteur très limitant pour étudier la réponse humorale dans les cancers.

Comme nous l’avons vu, les données actuelles concernant les autoanticorps sont prometteuses mais manquent d’études de validation. Dans l’avenir, la plupart des études devront être validées cliniquement dans de larges cohortes de patients indépendantes et multicentriques afin de déterminer la valeur des biomarqueurs potentiels en termes de sensibilité, spécificité et de valeur prédictive.