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Med Sci (Paris). 2012 June; 28(6-7): 584–587.
Published online 2012 July 16. doi: 10.1051/medsci/2012286010.

Protection des vaisseaux sanguins contre l’athérosclérose
Le rôle des miARN sécrétés par l’endothélium

Karine Tréguer,1,2* Susanne Heydt,1 and Eduard Hergenreider1

1Centre for Molecular Medicine, Institute of Cardiovascular Regeneration, University of Frankfurt Medical School, 60590Frankfurt am Main, Allemagne
2Adresse actuelle : UMR CNRS 5164, université Bordeaux 2, 146, rue Léo Saignat, 33076Bordeaux, France
Corresponding author.

MeSH keywords: Athérosclérose, génétique, anatomopathologie, prévention et contrôle, Vaisseaux sanguins, effets des médicaments et des substances chimiques, métabolisme, Communication cellulaire, physiologie, Cellules cultivées, Cytoprotection, Évaluation préclinique de médicament, Expression des gènes, Humains, microARN, pharmacologie, sécrétion, Modèles biologiques, Vésicules de sécrétion, Tunique intime

 

L’athérosclérose, maladie fréquente correspondant à la modification pathologique des artères, est la cause de nombreuses maladies telles que l’infarctus du myocarde et les accidents vasculaires cérébraux. Dans les pays développés, ces pathologies associées représentent la première cause de mortalité et constituent un enjeu important de santé publique. L’athérosclérose est un phénomène progressif normal au cours de la vie, mais qui peut devenir pathologique s’il s’accélère ou s’amplifie. En effet, les artères sont le siège de dépôts évoluant avec l’âge au niveau de leur paroi : c’est le vieillissement artériel. Ce processus peut être aggravé par les perturbations du flux sanguin perçues par les cellules endothéliales (CE). Dans les zones de turbulences, en général proches des bifurcations artérielles ou d’une plaque d’athérome, le flux sanguin n’est plus laminaire, il est turbulent, ce qui induit une diminution des forces de cisaillement1. Cette information va être transmise aux cellules musculaires lisses (CML) qui entourent les vaisseaux. Les CML vont alors s’activer, se dédifférencier et proliférer, ce qui accélère et aggrave le phénomène d’athérosclérose naturel [ 1] (Figure 1). Ces dernières années, le facteur de transcription Krüppel-like factor 2 (KLF2) a été identifié comme un senseur jouant un rôle clé dans les effets bénéfiques athéroprotecteurs du flux laminaire dans les vaisseaux [ 2]. En l’absence de KLF2 dans les CE, les souris meurent au stade embryonnaire E10,5 ; leur phénotype associe une absence de tonus vasculaire, des hémorragies et des dysfonctionnements cardiaques secondaires à des complications vasculaires [ 3, 4]. De façon intéressante, l’endothélium de ces souris est normal, ce qui n’est pas le cas des CML, dysfonctionnelles et désorganisées. Cette observation indique que l’expression endothéliale de KLF2 exerce un rôle physiologique important sur la couche sous-jacente de CML [ 5]. Nous nous sommes donc intéressés au mécanisme de cette communication entre les CE et les CML conduisant à l’effet athéroprotecteur relayé par KLF2 [ 6] (Figure 1).

Les miARN : un nouveau niveau de régulation de l’expression génique

Des médiateurs de choix de cette communication entre CE et CML seraient les microARN (miARN). Les miARN sont de petits ARN non codants simple brin (22 nucléotides) qui sont transcrits dans le noyau, clivés - notamment par les enzymes Drosha et Dicer -, et incorporés dans un complexe de silencing qui conduit à l’inhibition de la traduction ou à la dégradation des ARNm cibles [ 7, 17]. Ces molécules sont déjà connues pour leur rôle important dans la vascularisation ainsi que dans différentes pathologies vasculaires [ 8]. Notre objectif a été de déterminer si KLF2 pouvait réguler l’expression de miARN dans les CE et contribuer à ces effets vasculoprotecteurs.

Les forces de cisaillement régulent l’expression de miARN dans les CE via KLF2
Nous avons tout d’abord déterminé les miARN régulés par KLF2 et par les forces de cisaillement dans les CE. Cette double analyse a permis d’identifier de nouvelles cibles de KLF2 en réponse au flux : le cluster miR-143/145. Nous avons validé ces miARN candidats par l’invalidation de KLF2 in vitro, et nous avons montré qu’en absence de KLF2, ce cluster n’est plus induit par les forces de cisaillement. De plus, KLF2 est capable de se lier au promoteur de ce cluster et d’induire son expression. Les forces de cisaillement induisent donc l’expression de KLF2 dans les CE, et celui-ci, à son tour, induit l’expression de miR-143/145. Ce cluster était jusque là connu pour son action athéroprotectrice au niveau des CML [ 9].
miARN et communication intercellulaire : entre CE et CML
Nous avons cherché à vérifier si KLF2 pouvait contrôler les CML de façon paracrine via miR-143/145. De récentes études ont mis en évidence la présence de miARN extracellulaires dans les différents fluides de l’organisme [ 10], miARN circulants qui constituent de véritables traceurs biologiques dans différentes pathologies comme le cancer [ 11, 18] ou les maladies cardiovasculaires [ 12]. La fonction biologique des miARN circulants n’est pas encore complètement élucidée, mais il semble qu’ils puissent jouer un rôle dans la communication intercellulaire [ 13].

Le sang contient de nombreuses ribonucléases et les miARN circulants seraient protégés de la dégradation par des protéines de liaison ou par leur incorporation dans des vésicules [ 15, 16], ce dernier mécanisme étant privilégié (Figure 2A).

Nous avons analysé le surnageant de CE surexprimant KLF2 ou soumises à des contraintes de cisaillement. En utilisant la technique décrite dans la Figure 2 , nous avons pu montrer que ces miARN étaient présents dans le milieu extracellulaire et sont protégés dans une vésicule (Figure 2A). Différents types de vésicules ont été identifiés et classés en fonction de leur taille et de leur mécanisme de formation. Des analyses approfondies (notamment en microscopie électronique) nous ont permis de déterminer que les vésicules contenant miR-143/145 seraient de type microvésicules et/ou exosomes (MV).

Pour vérifier que les CML sont bien capables d’utiliser le contenu des vésicules émises par les CE, nous avons réalisé des cocultures entre des cellules endothéliales exprimant l’eGFP (green fluorescent protein) ou transfectées avec un miARN de C. elegans (cel-miR-39) et des CML sous-jacentes (Figure 2B). L’analyse par immunofluorescence des CML a montré la présence d’eGFP, et l’analyse RT-qPCR a révélé la présence des ARNm codant l’eGFP, démontrant que les CE ont transmis les vésicules d’ARNm aux CML. Par analyse RT-qPCR, nous avons également pu détecter la présence de cel-miR-39 dans les MV ; celles-ci sont transmises également aux CML cocultivées avec les CE transfectées par cel-miR-39. Les MV produites par les CE transportent des ARNm et des miARN et peuvent être incorporées par les CML.

Les miARN contenus dans les MV endothéliales ont un effet athéroprotecteur sur les CML
miR-143/145 étant exprimé par les deux types cellulaires, nous avons ensuite cherché à vérifier si l’apport de ces miARN par les CE agissait sur le phénotype des CML. Nous avons donc inhibé la production endogène de miARN dans les CML en inhibant Drosha (CML KO). Quand ces CML n’exprimant pas de miARN endogènes sont cultivées en présence de CE surexprimant KLF2, on y détecte une augmentation des miR-143/145. Ceci indique que miR-143/145 a été transporté des CE aux CML. Et nous avons montré que ces miARN captés par les CML KO y entraînent une réduction des cibles proathérosclérotiques, telles que ELK1 (E twenty-six like transcription factor I), KLF4 et SSH2 (sling­shot-I protein phosphatase) ; les miARN endothéliaux miR-143/145 transmis aux CML sont donc responsables des effets athéroprotecteurs observés au niveau des CML (Figure 3).

Nous avons vérifié in vivo l’effet athéroprotecteur de ces MV enrichies en miR-143/145 (produites par des CE surexprimant KLF2). Pour cela, les MV ont été injectées à des souris ayant des prédispositions à développer un processus d’athérosclérose (souris ApoE -/- ) lorsqu’elles sont nourries avec un régime gras, et nous avons quantifié les lésions artérielles. Les souris traitées présentent moins de lésions que les souris contrôles. De plus, l’inhibition de la production des miARN abroge l’effet bénéfique des MV observé in vivo.

Applications thérapeutiques

Ces travaux ont permis de mettre en évidence une communication entre les CE et les CML via les miARN circulants. En réponse au flux sanguin, l’activation de KLF2 permet la production des miR-143/145 qui sont transmis aux CML via des MV. Ces miARN dans les CML vont inhiber l’expression de facteurs proathérogéniques (Figure 3).

Ces résultats encourageants pourraient susciter des applications thérapeutiques intéressantes. Il pourrait être possible, grâce aux MV, de réduire le développement des plaques d’athérome chez les personnes à risque, notamment les personnes obèses. Cette stratégie pourrait s’appliquer à d’autres pathologies où l’expression des miARN est dérégulée (cancer, maladies cardiovasculaires), car les MV constituent un moyen de ciblage des traitements par miARN. Comme nous l’avons montré pour l’athérosclérose, l’administration des miARN via les MV pourrait se faire par voie intraveineuse. Les MV seraient produites in vitro à partir des cellules du patient lui même, réduisant ainsi le risque d’effets secondaires. Le choix du type cellulaire donneur permettrait d’adresser spécifiquement les miARN aux cellules cibles à traiter. De plus, les cellules productrices issues du patient peuvent être manipulées afin de modifier le contenu des MV qui seront délivrées aux cellules ciblées.

Liens d’intérêt

Les auteurs déclarent n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article.

 
Footnotes
1 Les forces de cisaillement, ou contraintes de cisaillement, sont les forces de friction exercées par le sang sur la paroi du vaisseau. Elles dépendent du débit sanguin, de la viscosité du sang et du diamètre du vaisseau. En l’absence d’obstacle ou de bifurcation, le flux est laminaire et les forces de ­cisaillement sont maximales.
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