Figure 1. Acquisition et visualisation en ligne des lames virtuelles. La lame de verre est numérisée par un système d’acquisition (ici un scanner). La LV produite est ensuite transférée sur un serveur de diffusion auquel se connectent à distance les utilisateurs. Les problématiques de stockage et de bande passante sont au cœur de la microscopie virtuelle compte tenu du volume de ces images. Si la totalité du fichier (jusqu’à 10 Go) est transférée sur le serveur de diffusion, la bande passante ainsi que l’ensemble des matériels nécessaires à sa visualisation sont minimaux (1 Mo/s). En effet, seules sont téléchargées les régions de l’image accédées par l’utilisateur et affichées sur son écran.

Figure 1. Acquisition et visualisation en ligne des lames virtuelles. La lame de verre est numérisée par un système d’acquisition (ici un scanner). La LV produite est ensuite transférée sur un serveur de diffusion auquel se connectent à distance les utilisateurs. Les problématiques de stockage et de bande passante sont au cœur de la microscopie virtuelle compte tenu du volume de ces images. Si la totalité du fichier (jusqu’à 10 Go) est transférée sur le serveur de diffusion, la bande passante ainsi que l’ensemble des matériels nécessaires à sa visualisation sont minimaux (1 Mo/s). En effet, seules sont téléchargées les régions de l’image accédées par l’utilisateur et affichées sur son écran.

Historiquement, le premier matériel d’acquisition de LV a été le microscope motorisé. Il conserve les mêmes fonctionnalités qu’un microscope standard, mais il est connecté à une caméra et est contrôlé par ordinateur. La platine sur laquelle est placée la lame se déplace sous l’objectif et une prise de vue est faite par la caméra à chacun des déplacements. Le microscope motorisé offre une grande souplesse d’utilisation, permettant à l’utilisateur de modifier les objectifs, de faire varier la luminosité ou de repositionner la préparation comme avec un microscope classique. Il permet, en outre, d’utiliser facilement un objectif à immersion (grossissement jusqu’à 100x). En revanche, parce qu’il nécessite une recalibration régulière, il est plus adapté à des volumes modérés de lames à numériser.

L’autre grand type de matériel d’acquisition, le scanner, est constitué de composants similaires à ceux des microscopes motorisés, mais ont été supprimés les oculaires ainsi que les outils de contrôle manuel de positionnement et de mise au point (Figure 1). Il est pourvu d’une seule ouverture pouvant recevoir jusqu’à plusieurs centaines de lames. Il utilise généralement un objectif 20x avec une grande ouverture numérique permettant une très bonne résolution des images finales. Un doubleur optique peut augmenter encore cette résolution, proche de celle que permet un objectif 40x. Il est également possible d’installer un véritable objectif 40x, au prix toutefois d’un allongement de la durée de numérisation. Destiné à la seule numérisation des LV, fiable et robuste, il est particulièrement adapté aux utilisateurs ayant des volumes de lames importants et des problématiques de numérisation dédiées et standardisées.

Figure 2. Numérisation et visualisation d’une image pyramidale. A. La numérisation d’une région d’intérêt par un microscope motorisé s’effectue par l’acquisition de tuiles carrées ou rectangulaires en parcourant la lame, avec des déplacements de zones en zones contiguës, d’un coin de la lame au coin opposé. B. La numérisation d’une région d’intérêt par un scanner s’effectue par une acquisition de longues bandes rectangulaires contiguës d’un coin de la lame ou de la région sélectionnée au coin opposé. C. Visualisation : lorsque l’utilisateur parcourt la lame à partir de l’aperçu de son ensemble, il peut accéder aux tuiles des différents grossissements, des plus faibles aux plus importants, jusqu’à la résolution maximale (image de base). Si l’image au niveau de grossissement inférieur souhaité n’a pas été numérisée lors de l’acquisition, le logiciel de visualisation génère, à partir de l’image de base, une image de la région à afficher à ce grossissement. Il est alors possible de faire varier le niveau de grossissement de manière continue entre la vue d’ensemble au faible grossissement et le grossissement maximum.

Figure 2. Numérisation et visualisation d’une image pyramidale. A. La numérisation d’une région d’intérêt par un microscope motorisé s’effectue par l’acquisition de tuiles carrées ou rectangulaires en parcourant la lame, avec des déplacements de zones en zones contiguës, d’un coin de la lame au coin opposé. B. La numérisation d’une région d’intérêt par un scanner s’effectue par une acquisition de longues bandes rectangulaires contiguës d’un coin de la lame ou de la région sélectionnée au coin opposé. C. Visualisation : lorsque l’utilisateur parcourt la lame à partir de l’aperçu de son ensemble, il peut accéder aux tuiles des différents grossissements, des plus faibles aux plus importants, jusqu’à la résolution maximale (image de base). Si l’image au niveau de grossissement inférieur souhaité n’a pas été numérisée lors de l’acquisition, le logiciel de visualisation génère, à partir de l’image de base, une image de la région à afficher à ce grossissement. Il est alors possible de faire varier le niveau de grossissement de manière continue entre la vue d’ensemble au faible grossissement et le grossissement maximum.

Ces séries de fichiers sont assemblées en une image de dimension maximale. Le logiciel génère ensuite les grossissements intermédiaires à partir de l’image la plus détaillée grâce à des algorithmes de redimensionnement. Cette image produite est dite pyramidale (Figure 2C), c’est-à-dire composée de plusieurs fichiers ou régions d’intérêt, chacun étant désigné par des coordonnées (X, Y, Z, G) désignant à la fois l’emplacement dans l’image (en largeur, longueur et hauteur ; X, Y et Z) et le grossissement (G). Toutefois, le système peut également générer une seule image « plate » de format usuel (bmp, tiff, jpeg, etc.) en deux dimensions en assemblant les tuiles acquises pour un grossissement donné [2].

La durée de la numérisation et la taille du fichier généré sont proportionnelles à la surface à numériser, au nombre de plans focaux et au grossissement choisi : à titre d’exemple, une lame qui comporte un échantillon de 20 mm × 15 mm sera numérisée avec un objectif 40x en 5 à 10 min. En fonction de la compression choisie, elle occupera entre 1 et 10 gigaoctets (Go) pour une définition de l’ordre du gigapixels (10⁹ pixels).

Le viewer peut être installé localement sur l’ordinateur de l’utilisateur et permettre de regarder une LV elle aussi stockée localement. Un viewer installé localement peut également se connecter à un serveur distant qui lui transmet des flux d’images à travers le réseau. Enfin, la visualisation peut être faite en se connectant à une application web avec un navigateur internet usuel.

Il y a trois priorités pour les logiciels de visualisation : la qualité des images, la rapidité de leur affichage [ 4] et la compatibilité avec les ordinateurs ou périphériques utilisés. Une visualisation sans perte d’information par rapport à l’image acquise est donc essentielle. En outre, pour une navigation fluide dans le cas d’une visualisation à distance, seule est diffusée à l’écran la partie de la lame que l’observateur souhaite afficher. La bande passante requise pour diffuser les lames dépend ainsi, non pas du poids (en octets) de la lame, mais de la résolution de la fenêtre d’affichage à l’écran et du nombre d’utilisateurs connectés au système. La bande passante requise pour visualiser les LV s’accommode d’une connexion ADSL (asymmetric digital subscriber line) usuelle (10 mégabits par seconde [Mbps]). Enfin, la plupart des viewers sont compatibles avec la majorité des systèmes d’exploitation existants.

Par ailleurs, de nombreux outils sont intégrés aux viewers pour augmenter l’intérêt pédagogique ou diagnostique de la lame. Parmi ceux-ci, on peut évoquer la possibilité d’adjoindre des métadonnées, telles que des annotations ou des commentaires. Il est également possible de dépasser les limites du grossissement optique du microscope ou du scanner avec un zoom numérique. Un système multi-fenêtres permet de voir plusieurs lames simultanément : leur déplacement synchronisé est très utile pour observer plusieurs colorations différentes sur des champs identiques ou également pour l’analyse de TMA (tissue microarray) [ 6]. Outre les déplacements horizontaux et verticaux, il est possible d’effectuer des rotations ou d’afficher différents plans focaux sur une zone donnée. On peut également citer les projets de visualisation ultra-rapide des LV sur écran géant [ 7], ou en trois dimensions grâce à la numérisation de centaines de coupes tissulaires successives pour explorer l’image produite dans son épaisseur. Ce type d’analyse permet de rendre compte du volume des structures analysées par le pathologiste, et non simplement de leur surface [ 8].

Enfin, ces fonctionnalités peuvent être complétées par des logiciels d’aide au diagnostic grâce à des outils d’analyse d’image [ 9, 10], tels que le comptage automatique des noyaux de cellules présents sur la lame ou la mesure des surfaces de tissus.