Vignette (Photo © Inserm - Emmanuelle Soleilhac).

Notre connaissance des virus ne date pas d’hier ! Que l’on attribue la paternité de la découverte des virus à Pasteur et Koch en 1880 pour leur théorie germinale, à Dimitri Iwanowski en 1892 pour ses plants de tabac, ou encore à Martinus Beijerinick en 1898 pour sa vision moderne du contagium vivum fluidum (agent vivant infectieux), les particules virales sont l’objet de beaucoup d’attention depuis de nombreuses décennies. C’est particulièrement vrai du virus de la stomatite vésiculaire (VSV), un prototype qui a été très étudié et a contribué à des découvertes de processus autant cellulaires que viraux.

Membre de la famille des Rhabdoviridae, le VSV n’est pas endémique en Amérique du Nord et l’infection humaine est généralement asymptomatique [ 1, 2]. C’est un virus enveloppé en forme de balle de fusil contenant un génome d’ARN de polarité négative codant pour cinq protéines : la nucléocapside (N), la phosphoprotéine (P), la protéine de la matrice (M), la glycoprotéine d’enveloppe (G), et l’ARN polymérase ARN-dépendante (L) [1, 3]. On connaît maintenant en détail le cycle de réplication du VSV qui peut infecter une grande variété de types cellulaires et d’espèces diverses (Figure 1).

Figure 1. Cycle de réplication du VSV. Le VSV se lie via sa base aux cellules cibles par un trimère de glycoprotéines sur son récepteur encore inconnu. L’entrée se fait par une endocytose dépendante de la clathrine impliquant la polymérisation de l’actine. Suite à l’acidification de l’endosome, un changement de conformation de la protéine G permet la fusion menant à la libération du matériel génétique du virus dans le cytoplasme de la cellule infectée. La transcription et la réplication sont assurées par la polymérase virale associée à une combinaison de phosphoprotéines et/ou de protéines de la nucléocapside. Les protéines N liées au nouveau brin d’ARN de polarité négative seront amenées à la membrane, et le bourgeonnement de la particule, induite par la glycoprotéine avec l’aide de la protéine de la matrice, pourra générer de nouveaux virions réplicatifs.

Figure 1. Cycle de réplication du VSV. Le VSV se lie via sa base aux cellules cibles par un trimère de glycoprotéines sur son récepteur encore inconnu. L’entrée se fait par une endocytose dépendante de la clathrine impliquant la polymérisation de l’actine. Suite à l’acidification de l’endosome, un changement de conformation de la protéine G permet la fusion menant à la libération du matériel génétique du virus dans le cytoplasme de la cellule infectée. La transcription et la réplication sont assurées par la polymérase virale associée à une combinaison de phosphoprotéines et/ou de protéines de la nucléocapside. Les protéines N liées au nouveau brin d’ARN de polarité négative seront amenées à la membrane, et le bourgeonnement de la particule, induite par la glycoprotéine avec l’aide de la protéine de la matrice, pourra générer de nouveaux virions réplicatifs.

Il a été démontré récemment que l’entrée cellulaire se fait via la base du virus par l’attachement d’un trimère de glycoprotéines à son récepteur cellulaire encore inconnu [ 4]. Cette liaison induit l’internalisation du virion par une endocytose dépendante de la clathrine impliquant une polymérisation de l’actine [ 5]. Des études de cristallographie ont démontré qu’après la formation de l’endosome, l’acidification de la vésicule génère un changement de conformation de la protéine G qui permet l’interaction du virus avec la membrane endosomale et l’enclenchement du processus de fusion [ 6]. Ce changement d’état de la protéine G est dépendant du pH et réversible ; la protéine adopte une conformation inactive après l’étape de fusion [ 7].

La fusion du virus à l’endosome permet ensuite la libération du matériel génétique dans le cytoplasme de la cellule hôte. Dès lors, la polymérase virale associée à trois phosphoprotéines forme une transcriptase capable de générer de façon asymétrique les ARNm des cinq protéines virales. Elle est également responsable de l’ajout aux ARNm d’une coiffe méthylée en position 5’ et d’une queue poly-(A), sans l’intervention de protéine cellulaire [ 8]. Une fois atteint un niveau suffisant de nucléoprotéine traduite, celle-ci se combine avec une phosphoprotéine et la polymérase afin de former la réplicase qui donnera naissance à un brin d’ARN négatif à partir du brin mère positif. Des études de cristallographie ont permis de déterminer que P agit comme une chaperonne en conduisant N au site de réplication virale et en la stabilisant avec la polymérase associée à l’ARN. Puis, la protéine N se lie directement à l’ARN pour former un complexe oligomérique de haut poids moléculaire en forme d’anneau encapsidant le génome en son centre chargé positivement, afin qu’il résiste à la dégradation par les RNases [ 9].

Finalement, lors du bourgeonnement, la protéine M, à qui l’on doit la forme particulière en balle de fusil, pourra s’associer avec la protéine G à la surface cellulaire [ 10]. Cette dernière, via son domaine cytoplasmique, servira alors de signal de reconnaissance pour le complexe ARN-N et complètera l’assemblage du virus, toujours aidé par son association avec M [ 11].

Beaucoup d’études ont permis d’en apprendre davantage sur les différentes protéines du VSV. En effet, la protéine de la matrice (M), la plus petite mais la plus abondante du virion, est maintenant considérée comme la protéine clé pour l’assemblage, le bourgeonnement ainsi que l’induction de l’effet cytopathique du VSV [8, 12]. Ainsi, il a été démontré que la protéine M était responsable de l’arrondissement des cellules infectées, en raison probablement de sa capacité d’interaction avec la tubuline [ 13, 14].

D’autres études ont également établi que la protéine M joue un rôle important dans l’inhibition de la transcription et de la traduction cellulaires, via son interaction avec le complexe de la polymérase cellulaire [ 15] et le complexe d’initiation de la traduction eIF4F (eukaryotic initiation factor) [ 16] respectivement. D’autres particularités importantes de ce virus viennent du fait que la protéine M peut bloquer le transport nucléocytoplasmique d’ARNm via son interaction avec la protéine nucléaire NUP98 (nuclear pore complex protein 98) [ 17]. Lorsque la méthionine 51 (M_M51R) de M est mutée, l’interaction entre la protéine virale M et les nucléoporines cellulaires est inhibée, libérant l’export des ARNm et permettant, par exemple, la sécrétion de l’interféron (IFN) de type I par les cellules infectées [ 18, 19]. Ce virus muté est toutefois atténué par comparaison avec la souche virale parentale, l’altération de l’inhibition de la transcription et de la traduction cellulaires entraînant un retard de la lyse cellulaire [ 20].

Plusieurs études ont aussi décrit différents rôles de la glycoprotéine d’enveloppe (G) du VSV. Elle intervient dans l’attachement à la membrane et la fusion membranaire, et sa liaison à la protéine M permet d’accroître l’efficacité de bourgeonnement des particules virales [ 21]. Outre sa participation à l’assemblage des virions, cette protéine pourrait aussi induire une forme de cytotoxicité [ 22] et, dans certaines conditions, la lyse des cellules tumorales [ 23].

Des mutations dans la glycoprotéine du VSV ont aussi été associées à un potentiel oncolytique important. Les mutants G₅, G_5R, G₆ et G_6R, de l’isolat San Juan du sérotype Indiana sont, entre autres, actuellement étudiés dans cette perspective. Leur isolement a été fait sans mutagenèse selon leur phénotype : en effet, ils entraînent la formation de petites plages de lyse¹ en présence de cellules pouvant produire de l’IFN, mais des plages de taille normale en présence de cellules dont la voie de l’IFN est abolie, ce qui suggère leur capacité à induire cette molécule antivirale [ 24]. De plus, les mutants G₅ et G₆ s’avèrent être thermosensibles, en raison probablement de la substitution d’un acide aspartique en position 216 par une glycine qui éliminerait un lien ionique stabilisant la protéine. Les mutants G_5R et G_6R quant à eux, retrouvent leur résistance à des températures avoisinant les 40 °C. Ces mutants de la glycoprotéine du VSV sont des candidats très intéressants pour la recherche en oncolyse virale puisqu’ils se répliquent et affectent le métabolisme cellulaire de façon analogue au virus sauvage, tout en permettant la sécrétion d’IFN dans des fibroblastes murins, ce qui laisse présager une bonne protection des tissus sains avoisinant une tumeur [ 25] (Figure 2).

Figure 2. Induction de l’interféron-β par différents mutants du VSV. Comparaison de l’induction d’interféron-β 24 h après l’infection à faible multiplicité d’infection (MOI, 0,1) avec les souches sauvage (WT) et mutantes du VSV pour la protéine de la matrice (MM51R) et la glycoprotéine d’enveloppe (G5, G5R, G6, G6R). *** p < 0,001 par rapport au contrôle non infecté.

Figure 2. Induction de l’interféron-β par différents mutants du VSV. Comparaison de l’induction d’interféron-β 24 h après l’infection à faible multiplicité d’infection (MOI, 0,1) avec les souches sauvage (WT) et mutantes du VSV pour la protéine de la matrice (MM51R) et la glycoprotéine d’enveloppe (G5, G5R, G6, G6R). *** p < 0,001 par rapport au contrôle non infecté.

Au début des années 2000, plusieurs équipes ont pu établir un rôle direct de la protéine de la matrice (M) dans l’induction de l’apoptose des cellules infectées en réponse au stress occasionné par le blocage de l’exportation des ARNm du noyau et la diminution consécutive de la synthèse protéique [ 26, 27]. En se concentrant sur les nouvelles propriétés attribuées à la glycoprotéine d’enveloppe du VSV, notre laboratoire a également pu démontrer que certaines mutations de la protéine G peuvent contribuer à l’induction rapide et efficace de la mort cellulaire dans plusieurs types de cellules tumorales (Figure 3), et ce en raison d’une augmentation de l’apoptose des cellules infectées [25].

Figure 3. Mortalité cellulaire induite par différents mutants du VSV. Comparaison de l’induction de la mort cellulaire après 36 h d’infection à forte multiplicité d’infection (MOI, 20) avec les souches sauvage (WT) et mutantes du VSV pour la protéine de la matrice (MM51R) et la glycoprotéine d’enveloppe (G5, G5R, G6, G6R) sur une lignée cellulaire murine non transformée (L929) et trois lignées tumorales (3LL, MC57, B16).

Figure 3. Mortalité cellulaire induite par différents mutants du VSV. Comparaison de l’induction de la mort cellulaire après 36 h d’infection à forte multiplicité d’infection (MOI, 20) avec les souches sauvage (WT) et mutantes du VSV pour la protéine de la matrice (MM51R) et la glycoprotéine d’enveloppe (G5, G5R, G6, G6R) sur une lignée cellulaire murine non transformée (L929) et trois lignées tumorales (3LL, MC57, B16).

Avec le temps, les caractéristiques phénotypiques de l’apoptose ont été approfondies et un nouveau concept a vu le jour. Une apoptose « immunogène » signifie que la mort cellulaire est capable de déclencher une réponse immunitaire de l’hôte, généralement contre sa propre tumeur [ 56]. Ce processus implique principalement l’exposition de la calréticuline à la surface cellulaire et le relargage de HSP (heat shock protein) ou encore de HMGB1 (high-mobility group box 1 protein). L’expression de ces protéines permet, entre autres, aux cellules dendritiques de reconnaître les cellules apoptotiques et de déclencher une réponse immunitaire contre ces dernières. Nous avons d’ailleurs démontré que l’infection par VSV permet une augmentation significative de l’exposition de calréticuline à la surface cellulaire. Cette induction d’apoptose immunogène semble dépendre, entre autres, de la protéine M, puisque la souche mutante M_M51R n’induit pas une telle augmentation (Figure 4).

Figure 4. Expression cellulaire de la calréticuline en réponse à l’infection par différents mutants du VSV. Comparaison de l’expression de la calréticuline à la surface cellulaire après 12 h d’infection à forte multiplicité d’infection (MOI, 20) avec les souches de VSV sauvages (WT) et mutantes pour la protéine de la matrice (MM51R) et la glycoprotéine d’enveloppe (G5, G5R, G6, G6R). * p < 0,05 et ** p < 0,01 par rapport au contrôle non infecté.

Figure 4. Expression cellulaire de la calréticuline en réponse à l’infection par différents mutants du VSV. Comparaison de l’expression de la calréticuline à la surface cellulaire après 12 h d’infection à forte multiplicité d’infection (MOI, 20) avec les souches de VSV sauvages (WT) et mutantes pour la protéine de la matrice (MM51R) et la glycoprotéine d’enveloppe (G5, G5R, G6, G6R). * p < 0,05 et ** p < 0,01 par rapport au contrôle non infecté.

La protéine G a aussi été associée à l’induction de l’apoptose. Lors de son expression à la surface des cellules infectées, elle conduit à la fusion dépendante du pH de membranes cellulaires et, éventuellement, à la mort cellulaire associée à une déplétion métabolique et à une perte d’intégrité mitochondriale [ 28, 29]. Il a d’ailleurs été démontré que l’expression de la glycoprotéine d’enveloppe du VSV sur des cellules de mélanome murin pouvait permettre la fusion de ces cellules à des cellules dendritiques, et ainsi générer de puissants hybrides immunogéniques de courte vie [ 30]. Différents mutants de VSV (au niveau de la protéine G) ont également montré un potentiel d’induction de l’apoptose varié. Une combinaison de ces mutations, associées ou non à la mutation M51R de la protéine de la matrice, pourrait peut-être permettre une synergie des effets observés.

Les virus peuvent être utilisés comme outils thérapeutiques, et ainsi être manipulés afin d’induire efficacement la mort de cellules cibles. En y insérant des gènes d’intérêt, on peut les transformer en vecteurs dynamiques. Une perspective intéressante pourrait être d’utiliser la protéine apoptine, provenant du virus de l’anémie infectieuse du poulet, pour augmenter l’activité oncolytique de certains virus. Une des caractéristiques remarquables de cette protéine est sa capacité à induire directement l’apoptose et ce spécifiquement dans les cellules tumorales, les cellules primaires et non transformées étant résistantes [ 31]. Ce phénomène est dépendant de Bcl-2 et des caspases, et fait intervenir Apaf1 (apoptotic peptidase activating factor 1) et l’apoptosome dans l’induction de la mort induite par la mitochondrie [ 32]. L’insertion de cette protéine apoptine dans un virus comme le VSV pourrait conférer des propriétés oncolytiques additionnelles très intéressantes.

La lyse cellulaire directe et l’induction de la mort par apoptose immunogénique de cellules tumorales in vivo semblent attrayantes dans un but thérapeutique. C’est pourtant loin d’être la seule raison motivant l’utilisation du VSV dans un tel contexte. En effet, ce virus est un candidat très intéressant en raison de ses caractéristiques intrinsèques d’oncolyse. Il a été démontré que le VSV peut se répliquer préférentiellement dans les cellules ne répondant pas à l’IFN ou y étant résistantes, ce qui est le cas de près de 80 % des tumeurs humaines [3, 33]. Cependant, le VSV a aussi évolué afin d’échapper à un contrôle antiviral cellulaire dans les tissus sains. En effet, le blocage de l’exportation nucléaire des ARNm codant pour l’IFN par la protéine M permet au virus de se répliquer dans tout type cellulaire. C’est pourquoi l’étude de virus mutants au niveau de cette protéine entre autres, permet de sélectionner les souches capables de réplication dans les lignées tumorales déficientes pour cette voie de signalisation antivirale [3, 34– 37].

Dans une optique de thérapie utilisant des virus oncolytiques, il devient évident qu’il sera impératif de développer des outils sûrs, efficaces et ciblés afin d’optimiser les traitements de patients cancéreux. L’utilisation d’un virus chez un hôte affaibli par la maladie devra également être étroitement suivie. Des études menées par notre laboratoire, ainsi que d’autres, ont démontré que lors de l’administration intratumorale de 1,5 × 10⁹ particules de VSV, le virus était fortement contrôlé par les anticorps neutralisants et ne provoquait aucun signe de toxicité chez la souris. Toujours dans le cas du VSV, la production d’IFN, de même que la réponse immunitaire innée via la stimulation de la voie de signalisation MyD88 engagée par les Toll-like receptor-4 (TLR4) ou TLR7, jouent un rôle crucial dans le contrôle de l’infection par les cellules saines, limitant la réplication aux cellules tumorales [ 38– 40].

Le concept d’oncolyse virale est apparu dès le début du xx^e siècle, lors de l’observation d’une rémission soudaine chez une patiente atteinte de leucémie qui avait contracté une infection par le virus influenza [ 41]. On a alors réalisé que les mécanismes de protection, de réparation cellulaire et d’apoptose étaient déficients dans les cellules cancéreuses, celles-ci pouvant devenir des cibles pour certains virus [ 42]. Les virus infectent souvent plusieurs types de cellules, mais l’infection ou la dissémination sera contrôlée dans les cellules saines, tandis que les cellules tumorales seront le lieu d’une réplication virale efficace. Lors de la lyse de ces cellules, des particules virales et différents antigènes tumoraux seront relâchés. Ce sont ces antigènes tumoraux, dans un contexte pro-inflammatoire induit par l’infection, qui pourront être reconnus par des cellules présentatrices d’antigènes professionnelles, comme les cellules dendritiques, afin d’induire une réponse spécifique des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) (Figure 5).

Figure 5. Principe de la virothérapie oncolytique. Un virus oncolytique comme le VSV peut infecter une grande variété de types cellulaires. Cependant, des mécanismes de protection antivirale permettent aux cellules saines de limiter la réplication ou la dissémination du virus. À l’opposé, dans les cellules tumorales, les mécanismes de protection sont déficients, les rendant susceptibles à la réplication virale. Lorsqu’il y a lyse des cellules cancéreuses suite à l’infection, des antigènes tumoraux sont libérés dans le milieu extracellulaire et un microenvironnement pro-inflammatoire est créé. Le système immunitaire adaptatif est alors sollicité et les antigènes tumoraux peuvent être présentés par des cellules dendritiques afin de développer une réponse immunitaire contre la tumeur.

Figure 5. Principe de la virothérapie oncolytique. Un virus oncolytique comme le VSV peut infecter une grande variété de types cellulaires. Cependant, des mécanismes de protection antivirale permettent aux cellules saines de limiter la réplication ou la dissémination du virus. À l’opposé, dans les cellules tumorales, les mécanismes de protection sont déficients, les rendant susceptibles à la réplication virale. Lorsqu’il y a lyse des cellules cancéreuses suite à l’infection, des antigènes tumoraux sont libérés dans le milieu extracellulaire et un microenvironnement pro-inflammatoire est créé. Le système immunitaire adaptatif est alors sollicité et les antigènes tumoraux peuvent être présentés par des cellules dendritiques afin de développer une réponse immunitaire contre la tumeur.

Dans ce scénario, le virus sert donc d’inducteur et provoque la migration d’effecteurs immunitaires innés et adaptatifs au site tumoral. En effet, le microenvironnement tumoral se développe généralement de façon à contrer la reconnaissance immunitaire ou en induisant une immunosuppression. L’infection préférentielle des cellules tumorales par un virus comme le VSV permet de briser cet état de tolérance en favorisant une inflammation locale qui permet le recrutement des différentes cellules immunitaires et l’activation spécifique de lymphocytes T infiltrants.

Cependant, un des enjeux majeur, en particulier pour assurer un contrôle rigoureux de la dissémination virale, demeure le mode d’administration du traitement. Beaucoup d’études dans des modèles murins reposent sur l’infection intratumorale pour maximiser l’infection des cellules cibles, mais les résultats ne seront pas toujours transposables à l’humain. Il faudra alors envisager le développement d’une administration systémique, ce qui peut engendrer l’élimination du virus par le système immunitaire avant même que celui-ci ne parvienne au site d’intérêt. C’est pour ces raisons que plusieurs virus sont présentement étudiés, dont certains génétiquement modifiés pour cibler leur entrée dans des cellules tumorales bien précises, ou encore pour tenter d’échapper momentanément à la reconnaissance immune.

Durant les dernières années, plusieurs stratégies ont évalué comment contourner les obstacles liés à la virothérapie oncolytique [ 57]. Ainsi, il a été proposé d’insérer dans le génome de divers virus des sites de liaison à des microARN précis [ 43]. De cette façon, les cellules saines produisant ces microARN seront en mesure de reconnaître l’ARN viral et de le détruire afin de limiter l’infection. Les cellules tumorales, quant à elles, perdent souvent ces propriétés de régulation de l’ARN et donc ne peuvent contrôler efficacement l’infection.

D’autres équipes ont également trouvé des façons ingénieuses de « cacher » les particules virales au système immunitaire, soit en les adsorbant directement sur des lymphocytes T [ 44] ou encore en les recouvrant de molécules inertes, comme le polyéthylène glycol [ 45]. Ce processus serait très intéressant dans le cadre d’une thérapie par VSV puisque ce virus est très rapidement contrôlé par les anticorps neutralisants et rapidement reconnu par le complément, ce qui empêche pour le moment une administration systémique efficace.

La combinaison de molécules comme des inhibiteurs d’histones déacétylases ou certains agents alkylants avec les virus peut aussi avoir plusieurs avantages. Tandis que les enzymes peuvent influencer les modifications épigénétiques de la chromatine et affaiblir la réponse cellulaire antivirale [ 46], les agents alkylants (comme la cyclophosphamide), peuvent inhiber directement des lymphocytes T régulateurs ayant un effet plutôt suppresseur sur la réponse générée contre la tumeur [ 47].

On peut aussi miser sur l’effet synergique de deux virus pour une même cible. En effet, l’infection de cellules tumorales par le virus de la vaccine a le potentiel de rendre sensibles au VSV des cellules qui étaient préalablement résistantes en bloquant la cascade de réponse à l’interféron [ 48].

Plusieurs études cliniques utilisant des virus oncolytiques ont également été réalisées ou sont actuellement en cours en Amérique du Nord ainsi qu’en Europe (Tableau I) [ 49– 54]. Les souches virales faisant l’objet d’études de phase II et III dans le traitement de plusieurs types de tumeurs sont toujours plus nombreuses. Bien que variables, les résultats semblent somme toute très prometteurs [ 53, 55].

Finalement, il ne faut pas passer sous silence l’une des plus grandes percées dans le domaine de la virothérapie oncolytique : l’acceptation par les autorités chinoises en 2005 du premier virus oncolytique, issu d’un adénovirus H101 génétiquement modifié, pour le traitement des cancers du cou et de la tête. Cette percée va assurément favoriser la reconnaissance d’une telle option dans les traitements futurs contre le cancer.

Les différentes recherches en virothérapie oncolytique enrichiront notre compréhension des mécanismes de régression tumorale induits par les virus, dans le but éventuellement de proposer un traitement curatif alternatif aux patients cancéreux. En maîtrisant ces mécanismes, nous serons donc plus à même de manipuler et d’amplifier une réponse anti-tumorale en vue d’une thérapie ciblée et efficace.

Les auteurs déclarent n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article.

Les auteurs remercient Simon Janelle pour ses illustrations schématiques du cycle de réplication virale de même que du principe de la virothérapie oncolytique (Figures 1 et 5). Ils remercient également Jean-Jacques Perreault pour ses commentaires et suggestions sur le manuscrit. Alain Lamarre est titulaire de la chaire de Recherche Jeanne et J.-Louis Lévesque en immunovirologie de la Fondation J.-Louis Lévesque. Valérie Janelle est récipiendaire d’une bourse doctorale de la Fondation Armand-Frappier.