L’histoire des NADPH oxydases (Nox) a débuté il y a un peu plus de 30 ans avec la découverte d’un cytochrome de type b, présent dans les neutrophiles humains et associé à la respiration des cellules stimulées. Il a été dénommé - en raison de ses propriétés spectrales - cytochrome b₅₅₈, et représente le cœur redox de la NADPH oxydase des phagocytes [1]. C’est à partir des années 1999-2000 que d’autres isoformes du cytochrome b₅₅₈ ont été mises en évidence, donnant naissance à une nouvelle famille d’isoenzymes, celle des Nox [2]. Les Nox sont des hémoprotéines transmembranaires et des transporteurs d’électrons. Leur unique fonction est de catalyser la réduction de l’oxygène moléculaire en anion superoxyde O₂^•-, qui donnera par la suite les espèces réactives de l’oxygène (ROS), oxydantes et toxiques. Dans les neutrophiles stimulés au cours de la phagocytose ou dans l’inflammation, la consommation d’oxygène est foudroyante (respiratory burst), mais transitoire. Elle est abolie dans une maladie familiale, la granulomatose septique (chronic granulomatous disease, CGD) [3]. L’étude du cytochrome b₅₅₈ et de son dysfonctionnement dans la CGD a servi de fil conducteur pour comprendre les mécanismes fonctionnels et de régulation des NADPH oxydases.

Bien qu’ayant un certain nombre de points communs, les Nox des cellules non phagocytaires chez l’homme se distinguent de la NADPH oxydase des neutrophiles, tant au plan fonctionnel que structural [12, 13].

Les Nox n’ont pas encore été cristallisées. Sur un plan topologique, Nox2 est l’isoenzyme le mieux caractérisé avec deux domaines : l’un est transmembranaire (TM), l’autre, présent dans le cytoplasme, est le domaine déshydrogénase (DH). Ce dernier est le domaine catalytique ; il présente une homologie de séquence avec les protéines de la famille des ferrédoxine-NADP réductases, et porte les sites de liaison non covalente du FAD et du NADPH. Les extrémités amino- et carboxy- terminales de Nox2 sont situées dans le cytoplasme. La topologie des autres isoformes est en revanche spéculative et repose sur des homologies de séquence avec Nox2, des programmes de prédiction de structure, des courbes d’hydropathie et le marquage d’épitopes à l’aide de cohortes d’anticorps monoclonaux.

La structure transmembranaire (TM) en position amino-terminale de Nox2 est constituée de six hélices α formant six piliers transmembranaires connectés par cinq boucles : les boucles A, C et E sont situées dans le milieu extracellulaire saturé en oxygène, et les boucles B et D font face au cytoplasme où se trouve le domaine catalytique (Figure 1). Les piliers 3 et 5 fixent, par des liaisons de coordinence au niveau de quatre histidines, deux hèmes non identiques au plan du potentiel redox : hème A (- 225 mV) et hème B (- 265 mV). Ces histidines, en position His101, His115, His209, His222 dans la séquence de Nox2, sont conservées dans toutes les Nox. L’hème A est positionné dans la membrane du côté cytoplasmique, l’hème B est à l’opposé. Ces deux hèmes sont directement impliqués dans le transfert d’électrons. La taille des boucles A, C, D et E diffère entre les isoenzymes ; ces variations peuvent être à l’origine de caractéristiques propres à chacun d’entre eux. Ainsi, dans le cas de Nox4, la boucle E contient 28 acides aminés de plus que celle de Nox2 ; elle serait intimement impliquée dans le fonctionnement de l’oxydase Nox4, notamment dans sa capacité à générer directement du H₂O₂(Figure 2A) [14]. Seule la boucle B présente une homologie considérable entre toutes les Nox, à l’exception de Nox5 et des Duox. Située du côté intracellulaire, elle est reliée au niveau des piliers transmembranaires 2 et 3. Des données récentes proposent un modèle dans lequel la boucle B pourrait servir d’interface entre les domaines transmembranaire et déshydrogénase, cette interface impliquant la présence d’une région conservée polybasique PBR (Nox1, 2, 3 et 4) (Figure 2A) [15]. Le repliement de la séquence conduirait ainsi le FAD à proximité de l’hème A (environ 22 Å) et favoriserait un transfert rapide d’électrons. Le sous-domaine de liaison du NADPH contiendrait les éléments majoritairement impliqués dans cette interface.

Dans les neutrophiles, gp91phox ou Nox2 est la sous-unité catalytique du cytochrome b₅₅₈. Son partenaire non catalytique est p22phox. Nox2 seul est inactif et doit s’associer à p22phox pour former un hétérodimère non covalent, mais stable. P22phox est également le partenaire des Nox1, Nox3 et Nox4. La maturation du cytochrome b₅₅₈ des neutrophiles a lieu dans deux sites, le réticulum endoplasmique, qui forme le précurseur mannose (65-kDa) au niveau duquel se lient les hèmes et par la suite p22phox, puis l’appareil de Golgi,  qui génère la forme mature de Nox2 (91-kDa). La glycosylation des Nox (Tableau I) n’affecte pas l’activité catalysée, à l’exception de celle des Duox, mais peut stabiliser un état conformationnel, voire la structure tridimensionnelle de la forme active. L’absence de N-glycosylation dans les Duox empêche leur expression à la surface des cellules thyroïdiennes [16].

Sur le plan fonctionnel, Nox2 est supposée avoir la structure oligomérique d’un dimère : à l’équilibre, il suffit d’une molécule de NADPH pour transférer deux électrons à deux molécules d’oxygène, au travers des centres redox de Nox2 via le FAD qui est réduit successivement en FADH^•, puis en FADH₂(Figure 3A). Si le transfert d’énergie est favorable entre NADPH et l’oxygène, il ne l’est pas entre les deux hèmes. Un milieu aérobie est donc nécessaire. En l’absence d’oxygène, la vitesse de transfert est fortement diminuée [17]. Sur un plan structural et à l’état basal, chacun des hèmes présente un état « hexacoordiné^1, ». L’activation du cytochrome b₅₅₈ par l’acide arachidonique conduirait au passage transitoire de la forme « hexacoordinée » de l’hème B, vers une forme « pentacoordinée », capable de réagir avec l’oxygène [12]. La preuve expérimentale d’une structure oligomérique des Nox a été apportée avec Nox5 [18]. Un tétramère d’environ 350 kDa serait la conformation active de Nox5 et se formerait, dans la membrane plasmique, par assemblage des domaines déshydrogénase.

Figure 3. Structure et mécanisme de transfert d’électrons. A. Mécanisme de transfert d’électrons d’après [12, 44]. Nox2/gp91phox est supposé être organisé en dimère. Le transfert des deux électrons fournis par le NADPH (étape 1) s’effectue en sept étapes avec un transport du premier électron à partir du FADH2 (étapes 2, 3 et 4) pour former le premier O2• -. Le deuxième électron est transporté à la suite du premier à partir du radical FADH• (étapes 5, 6 et 7) pour générer le deuxième O2•-. L’activité diaphorase (étape 1) est portée par la portion cytosolique de la protéine. B. Image de microscopie à force atomique (AFM) montrant, en 3D, le complexe de la NADPH oxydase, reconstitué dans des liposomes après assemblage dans les neutrophiles stimulés. La hauteur estimée du complexe oxydase assemblé est de 4 nm [23]. C. Modèle d’organisation topologique de l’interaction entre les deux sous-unités du cytochrome b558, Nox2 et p22phox dans le complexe activé. La génération d’anticorps monoclonaux dirigés contre les deux sous-unités du cytochrome b558, Nox2 et p22phox, marquant préférentiellement le cytochrome b558 dans sa forme active, a permis, après détermination des épitopes reconnus par ces anticorps, de proposer un modèle d’activation du cytochrome b558 qui favoriserait un rapprochement spatial entre des régions extracellulaires de Nox2 (2e boucle extracellulaire, boucle C) et de p22phox (110GTACLAIAS118) (ACm 13B6) [26], et entre les parties cytosoliques des deux sous-unités (Nox2, 559GPR561 et p22phox, 155PPPRPP160) (ACm 12E6) [25].

Figure 3. Structure et mécanisme de transfert d’électrons. A. Mécanisme de transfert d’électrons d’après [12, 44]. Nox2/gp91phox est supposé être organisé en dimère. Le transfert des deux électrons fournis par le NADPH (étape 1) s’effectue en sept étapes avec un transport du premier électron à partir du FADH2 (étapes 2, 3 et 4) pour former le premier O2• -. Le deuxième électron est transporté à la suite du premier à partir du radical FADH• (étapes 5, 6 et 7) pour générer le deuxième O2•-. L’activité diaphorase (étape 1) est portée par la portion cytosolique de la protéine. B. Image de microscopie à force atomique (AFM) montrant, en 3D, le complexe de la NADPH oxydase, reconstitué dans des liposomes après assemblage dans les neutrophiles stimulés. La hauteur estimée du complexe oxydase assemblé est de 4 nm [23]. C. Modèle d’organisation topologique de l’interaction entre les deux sous-unités du cytochrome b558, Nox2 et p22phox dans le complexe activé. La génération d’anticorps monoclonaux dirigés contre les deux sous-unités du cytochrome b558, Nox2 et p22phox, marquant préférentiellement le cytochrome b558 dans sa forme active, a permis, après détermination des épitopes reconnus par ces anticorps, de proposer un modèle d’activation du cytochrome b558 qui favoriserait un rapprochement spatial entre des régions extracellulaires de Nox2 (2e boucle extracellulaire, boucle C) et de p22phox (110GTACLAIAS118) (ACm 13B6) [26], et entre les parties cytosoliques des deux sous-unités (Nox2, 559GPR561 et p22phox, 155PPPRPP160) (ACm 12E6) [25].

La nature des ROS produits par Nox4 et la formation de H₂O₂ aux dépens de O₂^•- pourraient s’expliquer par des propriétés structurales spécifiques de Nox4 [14]. En effet, la boucle E de Nox4 contient une histidine, H222, conservée entre les espèces ; cette histidine pourrait servir de source de protons pour accélérer la dismutation spontanée de O₂^•- en H₂O₂(Figure 2A). Par ailleurs, l’intégrité de la boucle E, assurée par les deux cystéines C226 et C270, serait aussi nécessaire au bon fonctionnement de Nox4 et à la dismutation de O₂^•- en H₂O₂ [14, 19]. Un mécanisme commun serait observé avec les Duox ; le domaine amino-terminal extracellulaire de Duox1 joue un rôle similaire à celui de la boucle E de Nox4 [16].

Si le déficit de l’une ou l’autre des Nox a permis de comprendre leur fonctionnement et certains mécanismes enzymatiques fondamentaux de régulation, l’activité NADPH oxydase des Nox peut aussi être augmentée et cette augmentation entraîner un stress oxydant via le déséquilibre créé entre la production de ROS et leur dégradation. C’est ce que l’on observe dans les maladies inflammatoires, la polyarthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, ou encore les maladies du vieillissement, comme certaines formes de cancer, l’arthrose, la néphropathie diabétique, l’hypertension, les maladies cardiovasculaires, ou les maladies neurodégénératives. Dans la granulomatose septique, les infections multiples, graves et répétées observées dès le plus jeune âge, résultent d’une incapacité des phagocytes à tuer et digérer les microorganismes ingérés. Elles sont dues à un défaut de fonctionnement ou d’activation de la NADPH oxydase Nox2 [39, 40, 46]. Nox1 est impliquée dans la régulation de la pression artérielle et dans le remodelage vasculaire, sans oublier l’hypertension et l’athérosclérose [2]. Nox3 est fortement exprimée au niveau de l’oreille interne, et son absence conduirait à des troubles de l’équilibre [41]. Dans le rein, Nox4 joue un rôle de senseur de l’oxygène ; Nox4 interviendrait aussi dans la sénescence et l’apoptose, la prolifération cellulaire et l’immunité innée. Une expression élevée de Nox4 est rapportée dans l’athérosclérose, la fibrose pulmonaire et l’hypertension [9]. Si les fonctions de Nox4 restent encore mal comprises chez l’homme, des observations contradictoires sont observées chez les souris dont le gène codant pour Nox4 est invalidé ou au contraire surexprimé. Ces observations conduisent à une protection contre le stress oxydant ou la survenue d’un accident vasculaire cérébral ischémique, mais aussi à une meilleure résistance aux risques d’une atteinte cardiaque. Nox5 serait impliquée dans diverses fonctions vitales de la reproduction et de la maturation du sperme, bien que son absence chez les rongeurs interpelle sur son rôle dans l’organisme. Nox5 comme Nox1 jouerait un rôle significatif dans la prolifération cellulaire [8]. Enfin, l’hypothyroïdisme congénital aurait pour origine des mutations dans le gène de Duox2, affectant la formation de H₂O₂ et confirmant le rôle primordial de cette protéine dans la synthèse des hormones thyroïdiennes [16].

Un défi pour le futur est de définir le rôle spécifique des isoenzymes Nox dans les pathologies humaines. Des stratégies d’inhibition pharmacologique des Nox et de manipulation génétique dans des modèles animaux (souris invalidées pour ou surexprimant l’un des gènes Nox) ont été appliquées. Mais, des anticorps spécifiques contre chaque isoforme sont nécessaires pour une meilleure caractérisation des Nox dans ces modèles. La première validation d’une NADPH oxydase en tant que cible thérapeutique a été introduite avec les souris déficientes en Nox2, puis en Nox1 [2]. Un large champ pharmacologique concentré sur le développement d’inhibiteurs des Nox (petites molécules ou peptides) pourrait offrir une option thérapeutique prometteuse, en dépit d’une sélectivité encore limitée des composés vis-à-vis des isoformes des Nox [35, 42, 43]. Certaines molécules, cependant, sortent du lot comme le VAS2870 (Vasopharm GmbH), le ML171 (Scripps research institute) ou encore l’Ebselen. Parmi eux, la molécule GKT137831 (Genkyotek), ciblant Nox1/Nox4, est le premier inhibiteur en phase de développement clinique. Le champ des anticorps thérapeutiques ouvre aussi des perspectives fascinantes : parmi ceux-ci, des anticorps monoclonaux obtenus récemment et dirigés contre Nox2 [26] ou Nox4 [11, 14] devraient prendre une place importante en clinique humaine dans le futur.

Les auteurs déclarent n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article.

Les auteurs remercient tous les acteurs, collègues et partenaires, ainsi que les nombreux chercheurs qui ont pris une part active, depuis son origine, à cette histoire fascinante.