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Med Sci (Paris). 32(10): 836–839.
doi: 10.1051/medsci/20163210015.

La chimie-click débusque les substrats d’ADAM10

Mirca Saurty,1a Romain Sanson,1b Rania Amrane,1c and Eric Rubinstein2,3d

1M1 Biologie Santé, Université Paris-Saclay, 91405, Orsay
2Inserm U935, 94807Villejuif, France
3Université Paris-Sud, Université Paris-Saclay, Institut André Lwoff, 94807Villejuif, France
Corresponding author.

MeSH keywords: Protéine ADAM10, Animaux, Axones, Encéphale, Membrane cellulaire, Cytokines, Humains, Protéines et peptides de signalisation intercellulaire, Protéines membranaires, Souris, Gaine de myéline, Neurones, Spécificité du substrat, Synapses, métabolisme, physiologie, enzymologie

 

Les protéines de la famille ADAM (a desintegrin and metalloprotease) sont des métalloprotéases membranaires dont le rôle est de cliver diverses protéines membranaires libérant ainsi leur partie extracellulaire, ou ectodomaine. Ces protéases sont notamment responsables, via ce mécanisme, de la sécrétion de cytokines et de facteurs de croissance synthétisés sous forme de précurseurs membranaires, par exemple le tumour necrosis factor alpha (TNFα) ou les ligands du récepteur de l’EGF (epidermal growth factor) [1]. ADAM10 en particulier joue un rôle essentiel dans la signalisation en aval des récepteurs Notch, une voie de signalisation majeure au cours du développement et qui contrôle l’homéostasie de nombreux tissus. Le clivage du domaine extracellulaire des récepteurs Notch par ADAM10 permet en effet un deuxième clivage transmembranaire par la γ-sécrétase, permettant alors la libération du domaine cytosolique de Notch, qui peut exercer son action de cofacteur de transcription dans le noyau [1].

Un autre substrat majeur d’ADAM10 est la protéine transmembranaire APP (amyloid precursor protein), le précurseur du peptide amyloïde bêta (Aβ) impliqué dans la maladie d’Alzheimer [1]. Son clivage par ADAM10 empêche la formation du peptide Aβ, ce qui a conduit certains chercheurs à proposer la stimulation de l’activité d’ADAM10 comme une approche thérapeutique possible dans la maladie d’Alzheimer [2].

L’importance physiologique d’ADAM10 est soulignée par le fait que les souris knock-out pour le gène correspondant meurent au stade embryonnaire. Lorsque le gène codant ADAM10 est invalidé spécifiquement dans les neurones après la naissance, les souris présentent des épisodes d’épilepsie, des déficits d’apprentissage et des altérations des structures postsynaptiques [3]. Cependant, les substrats connus d’ADAM10 n’expliquent qu’en partie ces phénotypes, incitant Kuhn et ses collègues à chercher d’autres substrats d’ADAM10 dans le système nerveux central [4].

Quand la chimie-click s’y colle

Les auteurs ont analysé par spectrométrie de masse quantitative le répertoire de protéines sécrétées par des neurones en culture selon qu’ils sont déficients ou non en ADAM10. Pour contourner l’obstacle de la létalité embryonnaire des animaux knock-out pour ADAM10, ils ont utilisé des neurones issus de souris dont le gène ADAM10 est flanqué de sites lox, et ont induit la délétion d’ADAM10 in vitro en transduisant la recombinase Cre1via des lentivirus. Un second obstacle lors de l’analyse du sécrétome est la présence de protéines issues du sérum et de protéines cytosoliques relâchées par les cellules mortes. Cette difficulté a été contournée en utilisant la chimie « click » (voir Encadré 1) : les cellules ont été incubées avec un dérivé du mannosamine qui réalise un marquage métabolique des protéines glycosylées. Ce dérivé (ManNAZ) porte une fonction azide qui permet son couplage par chimie-click à d’autres molécules portant une fonction alkyne ou dibenzocyclooctyl (DBCO). Ainsi, seules les glycoprotéines nouvellement synthétisées sont effectivement marquées ; elles peuvent ainsi être couplées à la biotine par chimie-click, ce qui permet leur purification avec de la streptavidine.

De nouveaux substrats neuronaux d’ADAM10 identifiés !

L’approche non biaisée adoptée par les auteurs a permis d’identifier 313 glycoprotéines d’origine cellulaire dans le milieu des neurones en culture, dont 200 sont des protéines membranaires. Près de la moitié d’entre elles (principalement des protéines membranaires de type I) sont présentes en quantité significativement diminuée en l’absence d’ADAM10, et représentent donc des substrats potentiels de la protéase.

La grande majorité des protéines dont la libération dépend d’ADAM10 sont des molécules d’adhérence et des récepteurs. Parmi ces protéines, la seule cytokine identifiée est la chimiokine CX3CL1 (C-X3-C motif chemokine ligand 1) ou fractalkine. Cette chimiokine, substrat connu d’ADAM10, pourrait avoir un rôle neuroprotecteur en diminuant l’activation des cellules microgliales [7]. Il est cependant possible que d’autres cytokines n’aient pas été identifiées dans cette étude pour laquelle les auteurs ont fait le choix de s’intéresser aux protéines de plus de 30 kDa.

1. La chimie-click en biologie

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Le concept de chimie-click a été introduit en 2001 par Sharpless [5]. Il définit un groupe de réactions chimiques quasi parfaites, modulables, simples à mettre en oeuvre et se produisant en absence de solvant. Si la plus connue est la réaction de cycloaddition azoture-alcyne catalysée par le cuivre (CuAAC), des approches sans cuivre ont été développées, notamment celles utilisant le DBCO (dibenzocyclooctyl) employé par Kuhn et al. [4]. Ces réactions sont d’une grande sélectivité, permettant de coupler divers types de molécules fonctionnalisées sans interférer avec l’environnement biologique, et ont donc trouvé de nombreuses applications en biologie. Elles ont par exemple été utilisées pour le développement de nouvelles drogues, le marquage de biomolécules, ou différents types de marquages métaboliques (protéines, ADN, lipides) [6].

Un premier grand groupe fonctionnel de protéines membranaires dont le clivage est dépendant pour une large part d’ADAM10 est celui de protéines impliquées dans la formation et la fonction des synapses. Elles peuvent être localisées sur les membranes pré- ou post-synaptiques. Il s’agit parfois de molécules capables d’interagir en trans. C’est notamment le cas de certaines PTPR (protein tyrosine phosphatase, receptor type), et de leurs ligands sur la membrane post-synaptique, les protéines SLITRK (SLIT and NTRK-like) [8]. Plusieurs neuroligines2, présentes sur la membrane post-synaptique, sont également libérées de façon dépendante d’ADAM10 [9]. En revanche, les neurexines auxquelles elles se lient sont aussi sécrétées, mais de manière indépendante de cette protéase.

Un autre groupe de cibles potentielles d’ADAM10 joue un rôle dans le ciblage axonal. Il s’agit notamment de la néogenine (NEO1), récepteur de molécules de guidage axonal dont la nétrine [10], et de plusieurs membres de la famille des molécules d’adhérence L1 [11]. Les auteurs démontrent par ailleurs, pour renforcer l’hypothèse d’un rôle d’ADAM10 dans le ciblage axonal, des défauts de ce ciblage dans le bulbe olfactif et l’hippocampe chez les animaux knock-out pour ADAM10.

Les auteurs ont également étudié par la même approche le profil d’expression des protéines membranaires. Dans la plupart des cas, l’inhibition ou la diminution de la sécrétion des protéines étudiées provoquée par l’absence d’ADAM10 ne s’accompagnent pas d’un changement de leur expression au niveau cellulaire. Ceci suggère que le clivage de ces molécules par ADAM10 est régulé spatialement ou temporellement de façon très précise.

L’effet de l’absence d’ADAM10 sur la libération des protéines identifiées est très variable, l’inhibition pouvant varier de 30 % à 95 %. Ceci indique que certaines de ces protéines sont clivées par d’autres protéases ; il peut s’agir, dans certains cas mais pas dans tous, de BACE-1, dont l’activité est nécessaire à la production du peptide β-amyloïde [2]. Par ailleurs, les conséquences de l’absence d’ADAM10 peuvent être indirectes, la protéine incriminée n’étant pas une cible directe d’ADAM10. Par exemple, l’absence d’ADAM10 entraîne une diminution du clivage de la métalloprotéase MMP17 ancrée à la membrane ; ce qui pourrait retentir en retour sur le clivage des substrats de MMP17. Enfin, l’absence d’ADAM10 conduit à des modifications cellulaires allant au-delà du clivage de protéines membranaires, comme le montrent la modification de la sécrétion de protéines sécrétées via la voie classique (qui ne fait pas intervenir un clivage protéolytique), et l’augmentation de l’expression de la sous-unité gria1 du récepteur du glutamate AMPA (Figure 1).

Perspectives

En conclusion, cette analyse - la plus exhaustive à ce jour de la fraction du sécrétome modulée par ADAM10 - constitue un bel exemple des possibilités qu’offre la chimie-click aux biologistes. Elle montre que de nombreux substrats de l’enzyme sont impliqués dans la formation et les fonctions synaptiques, ainsi que dans le ciblage axonal, suggérant un rôle majeur d’ADAM10 dans ces fonctions, et expliquant ainsi une partie des phénotypes des animaux invalidés génétiquement pour ADAM10. La stimulation de l’activité d’ADAM10 a été proposée comme approche thérapeutique dans la maladie d’Alzheimer. La connaissance des substrats d’ADAM10 permettra une meilleure compréhension des effets secondaires potentiellement liés à cette approche.

Liens d’intérêt

Les auteurs déclarent n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article.

 
Footnotes
1 Le système de recombinaison Cre-lox utilise l’enzyme recombinase Cre, une tyrosine recombinase issue du bactériophage P1, afin de cibler des séquences loxP (également issues du bactériophage P1), permettant ainsi d’activer, réprimer, voire même échanger, les gènes situés entre les séquences lox.
2 Les mutations des neuroligines 3 et 4 ont notamment été impliquées dans une forme d’autisme touchant la jonction synaptique.
References
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Saftig P, Lichtenthaler SF. The alpha secretase ADAM10: a metalloprotease with multiple functions in the brain . Prog Neurobiol. 2015; ; 13 : :1.–20.
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Kuhn P, Colombo A, Schusser B, et al. Systematic substrate identification indicates a central role for the metalloprotease ADAM10 in axon targeting and synapse function . ELIFE. 2016; ; 5 : :e12748..
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