Vignette (Photo © Inserm - Daniel Poulain, Chantal Fradin).

Le monde microbien représente 50 % de la biomasse sur terre et de l’ordre de 10³⁰ cellules [1]. Les microbes ont colonisé l’ensemble de la planète que ce soit sous forme planctonique ou en association, notamment dans des biofilms ou en micro-agrégats [2] sous forme libre ou liée à des organismes hôtes. Antoni van Leeuwenhoek (1632-1723), naturaliste amateur et inventeur du microscope, fut probablement le premier à observer, à l’aide d’un microscope de sa fabrication, une communauté bactérienne provenant du grattage de ses dents. La microbiologie était née, mais il fallut encore attendre deux siècles et notamment des microscopes plus performants pour que cette discipline prenne une réelle importance. Elle fut alors, pour plus d’un siècle, profondément formatée par les concepts de Koch et de Pasteur. On s’intéressa avant tout à des organismes isolés, manipulés sous forme de cultures pures. Ces cultures pures ont permis de nombreuses observations majeures en microbiologie aussi bien dans le domaine de la santé que de l’environnement. Pourtant, il fut assez vite constaté que certaines bactéries observées au microscope dans des mélanges ne se retrouvaient pas à la suite des tentatives de culture [3].

Au cours des années 1980, Norman Pace, s’appuyant sur les résultats de séquençage d’ARN ribosomiques (ARNr) 16S de Carl Woese [4], commença à s’affranchir de l’obstacle de la culture en analysant, par PCR (polymerase chain reaction) et séquençage, les gènes d’ARN ribosomiques à partir de l’ADN extrait de communautés microbiennes [5]. Les ARN ribosomiques jouent un rôle central dans la synthèse protéique [6] (→), ce qui limite leur dérive évolutive et rend pratiquement impossible leur transfert horizontal. Ils constituent donc un identifiant très stable et fiable des organismes procaryotes et eucaryotes. C’est même autour de cette stabilité que s’est ancrée la notion d’espèce chez les bactéries ainsi que la classification phylogénétique. L’étude des communautés microbiennes, ou microbiotes, fut ainsi (re)lancée. Elle a connu, depuis une vingtaine d’années, un essor remarquable [7] (→).

(→) Voir l’article Nobel de P. Romby et al., m/s n° 11, novembre 2009, page 977

(→) Voir la Synthèse de C. Dauga et al., m/s n° 3, mars 2005, page 290

Les microbiotes sont universels et leur fonctionnement a été façonné par l’évolution. Les espèces qui les constituent se sont adaptées à leur voisinage au point parfois de ne plus pouvoir s’en passer. Si nous commençons à percevoir leurs effets sur le reste de la biosphère, sur les biomes¹ dont ils font partie et sur leurs partenaires non-microbiens, nous ne savons guère comment s’exercent ces effets. Quant à ce qui fonde l’existence des microbiotes et leur permet de se maintenir au cours du temps, nous en ignorons l’essentiel.

À défaut de pouvoir appréhender les microbiotes dans leur globalité, les microbiologistes ont adopté la démarche, habituelle, qui considère que les propriétés et les effets de ces microbiotes sont la résultante de l’action des espèces qui les composent. Cette action dépend, à l’évidence, des capacités biologiques encodées dans les gènes de ces espèces. Les travaux de Pace ouvraient la voie à la démarche moléculaire qui devait donner accès aux espèces et à leurs propriétés. On fit donc appel au ribotypage (c’est-à-dire à l’analyse des ARN ribosomiques) pour aborder des questions comme la composition des microbiotes, leur stabilité, résilience et dynamique, en fonction de divers facteurs comme le temps, le milieu et, le cas échéant, l’âge et l’état de l’hôte, etc.

La pratique du ribotypage fut rapidement généralisée et de nombreuses espèces inconnues furent identifiées. On eut ainsi la démonstration que la majorité des espèces bactériennes n’avait pas été isolée par les techniques classiques de microbiologie, en particulier, de culture microbiologique. On put aussi procéder à des recensements assez étendus de la composition en espèces des communautés microbiennes. Le degré variable d’apparentement des séquences d’ARNr 16S à une référence fut utilisé comme échelle de mesure pour inclure, ou exclure, un ribotype d’une espèce, d’un genre ou d’un phylum bactérien. À cette approche, appuyée sur le séquençage, s’ajouta rapidement une technique d’hybridation in situ à ces mêmes ARNr au moyen de sondes nucléiques fluorescentes [8], confirmant, d’une part, leur réalité au microscope et donnant, d’autre part, une estimation approximative de leur abondance au sein d’un microbiote. L’observation du signal d’hybridation permettait aussi de montrer que les bactéries concernées synthétisaient bel et bien des ARN ribosomiques et étaient donc biologiquement actives. Mais ces bactéries restaient en général réfractaires à la culture. On se disputa pour qualifier les espèces concernées : sont-elles non cultivables, non cultivées, viables non cultivables, etc. [9] ? De nombreuses hypothèses furent avancées pour expliquer notre incapacité à les mettre en culture.

L’hypothèse la plus simple fut l’absence d’un ou plusieurs nutriments, ce qui reflétait notre ignorance des besoins nutritifs et métaboliques des espèces non cultivées. Dans un microbiote, ces nutriments peuvent éventuellement devenir disponibles à la suite de leur production par des organismes présents dans le milieu. Des transferts entre espèces et la formation de véritables guildes² assurant une circulation de nutriments pouvaient rendre compte du phénomène [10]. Cette possible auxotrophie³ peut aussi être due à l’absence de molécules signal émises par certaines cellules pour stimuler la croissance des autres.

Alternativement, des conditions physico-chimiques inappropriées pourraient provoquer une mise en veille du métabolisme et d’autres activités qui serait réversible. Ces cellules devenues dormantes constitueraient une réserve capable de ressusciter et de se propager avec le retour de conditions de croissance qui seraient plus favorables [11]. Cette dormance pourrait aussi bien s’appliquer à des espèces cultivables connues qu’à des espèces non cultivées [7].

Pendant une bonne dizaine d’années, on s’appuya sur l’inventaire des espèces par ribotypage en extrapolant les caractéristiques métaboliques et physiologiques des représentants des espèces connues d’un microbiote. Mais, d’une part, ces inventaires ne nous disaient rien de plus sur les bactéries non cultivées dont les génomes restaient inconnus et, d’autre part, le séquençage du génome de plusieurs isolats d’une espèce définie par son ARNr 16S montrait souvent des différences sensibles entre les isolats, notamment, dans leur composition en gènes. Un cas assez emblématique est celui d’Escherichia coli dont les souches, MG1655 et 0157:H7, ont des génomes qui diffèrent d’un tiers de leur contenu [12]. Les génomes bactériens sont fréquemment l’objet de pertes ou de gains de régions génomiques pouvant aller de plusieurs kilobases (kb) à plusieurs dizaines, voire au-delà de la centaine de kb. Sans surprise, cette plasticité se traduit par des modifications sensibles de leur physiologie dont la variabilité, d’un isolat à l’autre, avait souvent été observée par des approches classiques de biochimie et d’immunologie.

La découverte de cette grande plasticité est le résultat direct des programmes de séquençage de génomes complets. Elle provoqua une révision majeure de notre compréhension des mécanismes de l’évolution des procaryotes. Alors qu’on avait longtemps cru que les génomes évoluaient essentiellement par de petits événements mutationnels, mutations ponctuelles et insertions ou délétions d’un ou quelques nucléotides (insertions/délétions ou INDEL), on comprit qu’ils étaient aussi profondément remaniés par des gains et des pertes de segments chromosomiques pouvant porter plusieurs dizaines de gènes, voire plus. Des analyses plus fines montrèrent de manière convaincante que les acquisitions de ces segments, ou îlots génomiques, résultaient d’un transfert horizontal entre bactéries pouvant être phylogénétiquement éloignées. Ces acquisitions d’îlots procurent aux procaryotes une capacité d’adaptation considérable que ce soit pour la colonisation de nouvelles niches, la résistance à des changements brutaux et drastiques du milieu ou la présence de prédateurs.

La variabilité des génomes de procaryotes nécessita aussi d’être intégrée dans notre conception de la taxonomie des espèces procaryotes basée pour l’essentiel sur l’ARNr 16S [13] (→).

(→) Voir la Nouvelle de V. Daubin et S.S. Abby, m/s n° 8-9, août-septembre 2012, page 695

Ceci aboutit au concept de pan-génome [14] dans lequel on distingua (1) le « core genome », c’est-à-dire un ensemble de gènes toujours présents et retrouvés dans tous les isolats appartenant à une même espèce et (2) le « dispensable genome », un autre ensemble de gènes, dont une part (très variable) pouvait être facultativement présente ou absente d’une souche à l’autre.

Pour étudier un microbiote, la meilleure manière de surmonter cette difficulté fut de prendre cette plasticité en compte et d’inventorier non seulement les espèces par l’ARNr 16S mais aussi les autres gènes (constants ou facultatifs) de ces espèces. Comme le séquençage massif se répandait et que les capacités des grands centres de séquençage devenaient plus disponibles, on commença à inclure la dimension génique dans l’étude des microbiotes. La métagénomique était née [15] et devait permettre, bien plus que le ribotypage, de renouveler en profondeur l’étude des communautés microbiennes de toute nature et de toute origine. Fut alors proposé le néologisme de microbiome (voir Encadré).

La métagénomique fut présentée comme la panacée pouvant apporter une réponse satisfaisante aux questions concernant les microbiotes. L’arrivée du séquençage de deuxième génération en particulier devait apporter la masse de données qui permettrait des progrès décisifs. On s’intéressa à de très nombreux types de microbiotes colonisant une grande variété d’environnements et occupant un nombre considérable de niches, soit en interaction avec d’autres organismes uni- ou multicellulaires (surfaces animales, rhizosphère, feuilles, coraux, etc.), soit libres, dans des milieux naturels, comme les sols et les eaux. Les communautés bactériennes sont ainsi devenues des sujets d’études majeurs illustrant leur importance dans les domaines de la santé et de l’environnement. Le volume de données produites est considérable. Il est impossible de résumer l’ensemble des résultats de ces analyses. Une partie notable des résultats concernant plus spécifiquement les microbiotes humains a été rapportée dans médecine/sciences et sera très peu discutée ici [16–20] (→).

(→) Voir : la Synthèse de R. Burcelin et al., m/s n° 8-9, août-septembre 2013, page 800 ; la Nouvelle de de P. Cani et A. Everard, m/s n° 2, février 2014, page 125 ; la Synthèse de C. Andréjak et L. Delhaes, m/s n° 11, novembre 2015, page 971 ; la Synthèse de C. Audebert et al., m/s n° 12, décembre 2014, page 1144 ; la Synthèse de A. El Kaoutari et al., m/s n° 3, mars 2014, page 259

On conçoit aisément que l’analyse de données fragmentaires issues d’un mélange de nombreuses espèces de génomes est une gageure. Une méthodologie s’est ainsi progressivement dégagée au fur et à mesure du développement de nouveaux outils informatiques [21] (Figure 1). Les microbiotes environnementaux furent les premiers à être étudiés [22], mais l’anthropocentrisme aidant, les résultats au plus fort impact et les plus nombreux concernent les métagénomes humains [23].

Figure 1. Déroulé d’une analyse métagénomique de microbiote. Dans un premier temps le microbiote d’intérêt est soumis à une extraction de l’ADN. L’ADN métagénomique obtenu peut être soumis à une étape d’amplification, pour augmenter les quantités disponibles. Il est ensuite séquencé par une méthode de nouvelle génération (en général). Les lectures obtenues sont souvent de taille très courte (100 pb, paires de bases). Les données brutes obtenues sont alors examinées par des procédures de contrôle qualité puis traitées à l’aide de logiciels capables de produire différents types d’analyses visant à déterminer le contenu en espèce (analyse taxonomique) ou en gènes (analyse fonctionnelle). Les principaux logiciels d’analyse taxonomique vont identifier les fragments d’intérêt et les comparer à des collections de séquences de référence. Les gènes de références utilisés sont principalement et très majoritairement les gènes qui encodent les ARN ribosomiques qui permettent une assignation à une espèce, un genre ou un phylum. Si on souhaite une analyse plus fine, on inclut des comparaisons à des gènes marqueurs présents en simple copie par cellule (par exemple ceux codant les protéines ribosomiques) ou qui sont spécifiques d’un groupe phylétique (c’est-à-dire spécifiques des espèces d’un même phylum). On peut allonger la longueur des fragments d’intérêt sélectionnés en procédant à l’assemblage des lectures correspondantes. Ces analyses débouchent sur l’identification des séquences de référence phylogénétiquement les plus proches. Elles peuvent être complétées par le positionnement des séquences analysées dans un arbre phylogénétique. Cette première analyse donne une idée sur l’identité et le groupe taxonomique de la séquence considérée. Une idée plus précise de l’appartenance à un groupe taxonomique peut être fournie par le « binning », un tri souvent basé sur la composition nucléotidique des fragments analysés. Il existe aussi des méthodes de tri qui utilisent d’autres stratégies. Pour augmenter la puissance des analyses, il est important de travailler avec les séquences les plus longues possibles et donc de procéder à des assemblages de séquences recouvrantes colinéaires préalablement à d’autres traitements. Mais, inversement, certains de ces traitements, comme le tri préalable, peuvent eux aussi augmenter la qualité des assemblages. Les choix stratégiques sont donc parfois délicats. Il existe de nombreux programmes d’assemblage de métagénomes dont les performances peuvent être différentes en fonction de la nature des données utilisées. Les traitements des inventaires « fonctionnels » des métagénomes sont en général les mêmes que ceux utilisés pour les génomes. Ils se pratiquent surtout sur les séquences assemblées. Traitements généraux (en ocre). Traitements « taxonomiques » et « fontionnels » (en vert). Méthodes ou ressources utilisées dans les traitements « taxonomiques » (en bleu). Résultats des traitements (en rouge).

Figure 1. Déroulé d’une analyse métagénomique de microbiote. Dans un premier temps le microbiote d’intérêt est soumis à une extraction de l’ADN. L’ADN métagénomique obtenu peut être soumis à une étape d’amplification, pour augmenter les quantités disponibles. Il est ensuite séquencé par une méthode de nouvelle génération (en général). Les lectures obtenues sont souvent de taille très courte (100 pb, paires de bases). Les données brutes obtenues sont alors examinées par des procédures de contrôle qualité puis traitées à l’aide de logiciels capables de produire différents types d’analyses visant à déterminer le contenu en espèce (analyse taxonomique) ou en gènes (analyse fonctionnelle). Les principaux logiciels d’analyse taxonomique vont identifier les fragments d’intérêt et les comparer à des collections de séquences de référence. Les gènes de références utilisés sont principalement et très majoritairement les gènes qui encodent les ARN ribosomiques qui permettent une assignation à une espèce, un genre ou un phylum. Si on souhaite une analyse plus fine, on inclut des comparaisons à des gènes marqueurs présents en simple copie par cellule (par exemple ceux codant les protéines ribosomiques) ou qui sont spécifiques d’un groupe phylétique (c’est-à-dire spécifiques des espèces d’un même phylum). On peut allonger la longueur des fragments d’intérêt sélectionnés en procédant à l’assemblage des lectures correspondantes. Ces analyses débouchent sur l’identification des séquences de référence phylogénétiquement les plus proches. Elles peuvent être complétées par le positionnement des séquences analysées dans un arbre phylogénétique. Cette première analyse donne une idée sur l’identité et le groupe taxonomique de la séquence considérée. Une idée plus précise de l’appartenance à un groupe taxonomique peut être fournie par le « binning », un tri souvent basé sur la composition nucléotidique des fragments analysés. Il existe aussi des méthodes de tri qui utilisent d’autres stratégies. Pour augmenter la puissance des analyses, il est important de travailler avec les séquences les plus longues possibles et donc de procéder à des assemblages de séquences recouvrantes colinéaires préalablement à d’autres traitements. Mais, inversement, certains de ces traitements, comme le tri préalable, peuvent eux aussi augmenter la qualité des assemblages. Les choix stratégiques sont donc parfois délicats. Il existe de nombreux programmes d’assemblage de métagénomes dont les performances peuvent être différentes en fonction de la nature des données utilisées. Les traitements des inventaires « fonctionnels » des métagénomes sont en général les mêmes que ceux utilisés pour les génomes. Ils se pratiquent surtout sur les séquences assemblées. Traitements généraux (en ocre). Traitements « taxonomiques » et « fontionnels » (en vert). Méthodes ou ressources utilisées dans les traitements « taxonomiques » (en bleu). Résultats des traitements (en rouge).

Chez l’homme, les approches s’appuyant sur des cultures laissaient entrevoir l’existence d’un socle commun à l’ensemble des microbiotes intestinaux. Cette notion est aujourd’hui remise en question. On observe une variation considérable d’une population à l’autre, entre individus d’une même population, mais aussi pour un même individu au cours du temps et selon le régime alimentaire [45] (→).

(→) Voir la Synthèse de R. Burcelin et al., page 952 de ce numéro

Au fur et à mesure de l’accumulation de nouvelles études, l’existence du socle commun devient de plus en plus improbable [24]

Des observations concernant la composition et les dynamiques des microbiotes sont souvent bien antérieures à l’usage de la métagénomique qui n’a fait que les documenter extensivement. Et, s’il est devenu possible de procéder à des inventaires de fonctions (voir ci-après), les analyses de métagénomique se heurtent au côté très fragmentaire des données de séquence produites par séquençage qui ne permettent que rarement d’associer des gènes (traduits par des phénotypes physiologiques) à un genre ou une espèce (Figure 1). En outre, l’observation d’un fragment d’ADNr 16S ne prouve pas la présence stable de l’espèce bactérienne concernée, qui peut être fortuite (espèce passagère) ou accidentelle.

L’inventaire des fonctions

L’inventaire des gènes est encore plus impressionnant que celui des espèces rencontrées [25–27]. Mais que peut-on en dire ? En dépit d’une différence de composition des espèces entre les microbiotes intestinaux, on retrouve une forte redondance fonctionnelle sous forme d’un socle de fonctions communes. Une grande partie de celles-ci concerne le métabolisme central et intermédiaire. Mais ceci n’est pas une surprise. Un système biologique, même rudimentaire doit disposer d’un degré minimal d’autonomie pour se maintenir et se reproduire. L’obtention de ce type de résultats a mobilisé des ressources qui semblent démesurées par rapport à leur signification. Certes, sans le secours de la bio-informatique, il eut été impossible de procéder à des analyses efficaces des données de métagénomique (Figure 1). Mais, même si elle fait sens, et elle le fait, la grande force de la bio-informatique reste la prédiction du prévisible.

C’est plutôt au niveau de fonctions, déjà partiellement connues, qu’on note des progrès. Ainsi a-t-il été possible d’analyser en profondeur certaines fonctions majeures du microbiote du côlon comme la digestion des polysaccharides [20]. De même, des résultats parlants avaient été obtenus pour des microbiotes de processus environnementaux déjà largement étudiés et relativement compris. Ceux-ci concernent, par exemple, le traitement des eaux où se produisent des étapes majeures de la minéralisation de substrats organiques dans le déroulement des cycles du carbone, de l’azote et du phosphore. De nouvelles étapes de ces cycles, comme le processus anammox (anaerobic ammonium oxidation) [28], ou l’oxydation anaérobie du méthane [29], avaient été décrites ces dernières décennies et leurs acteurs microbiens en partie identifiés. Les approches moléculaires ont cependant permis d’identifier certains gènes clés jusque-là inconnus.

Après 25 ans de génomique et 15 ans de métagénomique, la fraction des gènes connus au sein d’un génome procaryote n’a guère progressé et se situe toujours autour du tiers. Pour un second tiers il est possible de proposer une fonction vraisemblable. Quant au dernier tiers, il est constitué de gènes hypothétiques, sans fonction connue, se subdivisant en gènes conservés et non conservés. Avec l’accumulation de nouvelles séquences, certains gènes hypothétiques se révèlent être conservés alors que de nouveaux gènes hypothétiques sont prédits.

Toutes ces conclusions s’appuient sur l’utilisation des banques de données de séquence qui s’enrichissent sans discontinuer mais sont fortement biaisées par une surreprésentation des séquences provenant de génomes de pathogènes dont l’essentiel se restreint, de surcroît, à 3 phylums bactériens [30]. On note à l’inverse une sous-représentation des espèces environnementales et plus généralement un biais en faveur des cultivables [46] (→).

(→) Voir la Nouvelle de J.C. Lagier et D. Raoult, page 923 de ce numéro

Le séquençage a montré maintes fois que la fraction des gènes inconnus est plus élevée dans les espèces non cultivées.

Comme dans toute analyse de génomes, le résultat final débouche sur une double frustration : d’une part l’empilement de plus en plus démesuré de représentants additionnels de fonctions connues, notamment les plus étudiées et les plus universellement distribuées dans le vivant et, d’autre part, l’accroissement et l’élargissement inexorables des collections de gènes codant des fonctions inconnues. Les courbes de dénombrement de nouveaux gènes commencent cependant à tendre vers un plateau [25]. Pour le moment ces signes espérés de raréfaction s’observent surtout au niveau de biomes très étudiés (Figure 2). Mais ils montrent qu’on s’achemine vers une saturation progressive de l’inventaire des protéines de la biosphère.

Figure 2. Comparaison de courbes de raréfaction de catalogues de gènes de référence provenant de quelques grands projets d’analyse de métagénomes. 1. Les séquences de 243 échantillons d’ADN métagénomiques (68 sites océaniques) ont été assemblées et soumises à une analyse de prédiction de gènes produisant un total de 111,5 millions (M) de gènes. Ces gènes prédits ont été regroupés avec les jeux de séquences de gènes d’autres métagénomes océaniques disponibles publiquement (26 millions de gènes « externes »). L’analyse de regroupement (clustering) de séquences identiques à 95 % a fourni un ensemble de gènes de référence de 40 millions de gènes de métagénomes océaniques. La partie droite de la courbe montre un très faible accroissement de diversité pour l’addition des 100 derniers échantillons. 2. La partie encadrée compare les courbes de raréfaction des gènes procaryotes marins (courbe noire, 24 millions de gènes) et intestinaux (courbe rouge, 7 millions de gènes) à partir d’échantillons normalisés pour la couverture en séquence. La nette différence du niveau des asymptotes fait ressortir une plus grande diversité de gènes de procaryotes marins (d’après [26]).

Figure 2. Comparaison de courbes de raréfaction de catalogues de gènes de référence provenant de quelques grands projets d’analyse de métagénomes. 1. Les séquences de 243 échantillons d’ADN métagénomiques (68 sites océaniques) ont été assemblées et soumises à une analyse de prédiction de gènes produisant un total de 111,5 millions (M) de gènes. Ces gènes prédits ont été regroupés avec les jeux de séquences de gènes d’autres métagénomes océaniques disponibles publiquement (26 millions de gènes « externes »). L’analyse de regroupement (clustering) de séquences identiques à 95 % a fourni un ensemble de gènes de référence de 40 millions de gènes de métagénomes océaniques. La partie droite de la courbe montre un très faible accroissement de diversité pour l’addition des 100 derniers échantillons. 2. La partie encadrée compare les courbes de raréfaction des gènes procaryotes marins (courbe noire, 24 millions de gènes) et intestinaux (courbe rouge, 7 millions de gènes) à partir d’échantillons normalisés pour la couverture en séquence. La nette différence du niveau des asymptotes fait ressortir une plus grande diversité de gènes de procaryotes marins (d’après [26]).

Les auteurs déclarent n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article.