L’épissage des ARN pré-messagers prend place dans le noyau cellulaire. Il est assuré par un complexe de plus de 200 protéines associées ou non à des petites ribonucléoprotéines, les snRNP (small nuclear ribonucleoprotein) U1, U2, U4/U6 et U5 [1]. Le macro-complexe ainsi formé, le splicéosome, assure l’excision des introns et la ligature des exons, en un cycle bien caractérisé faisant intervenir deux réactions consécutives de trans-estérification (Figure 1A). L’architecture du splicéosome et l’intervention séquentielle des différents complexes ont été déterminées par un ensemble de travaux faisant appel à des méthodes de biochimie analytique et structurale [2]. Dans une première étape, les séquences cibles de l’ARN sont reconnues par les snRNP U1 et U2, formant le complexe A. Ensuite, le recrutement de la tri-snRNP U4/U6.U5 permet la formation du complexe B qui, à la suite de nombreuses modifications à la fois structurales et conformationnelles, devient le complexe B^act (présentant une activité catalytique) au sein duquel a lieu la première étape de la réaction d’épissage et la formation du complexe C. La seconde étape de trans-estérification est alors réalisée, les exons mis bout à bout, l’intron dégradé et les snRNP sont recyclées. Une famille d’hélicases à ARN dépendantes de l’ATP est impliquée dans les transitions entre chaque étape du cycle, permettant un remodelage des complexes indispensable à la réaction d’épissage [3, 50] (→).

(→) Voir également la Synthèse de P. De la Grange, page 1111 de ce numéro

Il est important de mentionner que le splicéosome existe sous deux formes partiellement superposables, le splicéosome « majeur » (voir plus haut), dont dépend la majorité des introns, et le splicéosome « mineur » qui prend en charge moins de 1 % des introns humains et utilise les snRNP U11, U12, U4atac, U5 et U6atac [4]. Les introns reconnus par le splicéosome mineur présentent des sites AT (site 5’) et AC (site 3’), ou des sites consensus reconnus par le splicéosome majeur, GT (en 5’) et AG (en 3’). Ces introns reconnus par le splicéosome mineur sont enrichis au sein des gènes impliqués dans la réplication et la réparation de l’ADN, dans la transcription, l’épissage et la synthèse protéique, mais sont absents des gènes du métabolisme énergétique et des voies de biosynthèse.

Plusieurs déterminants de séquence, présents dans les introns, permettent à la machinerie de « définir » les exons. Il s’agit des sites 5’, ou sites donneurs d’épissage, des sites 3’, ou sites accepteurs d’épissage, du site de branchement vers l’extrémité 3’ de l’intron, et d’une étendue de pyrimidines située entre le site de branchement et le site 3’ (Figure 1B). Les séquences consensus retrouvées au niveau des sites d’épissage sont suffisamment robustes pour que différents algorithmes informatiques puissent déterminer les jonctions introns-exons et donc prédire leur utilisation probable par le splicéosome. Néanmoins, ces séquences ne possèdent pas toutes la même capacité à attirer la machinerie d’épissage et, lorsque certaines d’entre elles ne sont pas reconnues par le splicéosome, l’épissage devient alternatif.

L’activité d’épissage peut être influencée par des protéines agissant via différents sites, présents dans les exons et dans les introns, voire par interaction directe avec le splicéosome. De façon générale, ces protéines se répartissent en deux familles principales, les protéines SR (riches en sérines et arginines) et les hnRNP (heterogenous nuclear ribonucleoproteins) qui respectivement favorisent ou réfrènent l’inclusion normale des exons [5]. Cette « règle », dérivée de l’observation, admet pourtant des exceptions, de sorte que les rôles positifs ou négatifs peuvent revenir respectivement aux hnRNP et aux protéines SR, en particulier selon l’environnement nucléotidique. Ces protéines peuvent lier des séquences introniques ou exoniques activatrices (les ISE [intronic splice enhancer] et les ESE [exonic splice enhancer]) ou inhibitrices (les ISS [intronic splice silencer] et les ESS [exonic splice silencer]), stimulant ou réduisant par là-même, la capacité des complexes du splicéosome à catalyser la réaction d’épissage, vraisemblablement par une interaction directe avec certains des composants du système (Figure 1B). Certains membres d’une même famille peuvent parfois présenter des spécificités d’expression tissulaire marquées comme, par exemple, les protéines NOVA enrichies au niveau du cerveau [6]. De fait, les prédictions informatiques de la position des sites d’activité des protéines SR et hnRNP sont sensiblement moins performantes que celles des sites consensus évoqués plus haut.

Plusieurs types d’épissage alternatif ont été caractérisés, dont l’événement majoritaire est l’exclusion d’un exon (dit exon cassette). Des exclusions mutuelles d’exons cassettes, la rétention de segments introniques ou l’activation de sites cryptiques dont la séquence et/ou l’environnement proche ne sont normalement pas reconnus par la machinerie d’épissage, ont également été identifiés (Figure 2) [7] (→).

(→) Voir la Synthèse de L. Corcos et L. Solier, m/s n° 3, mars 2005, page 253

Selon la base de données « Human Gene Mutation Database » (HMGD), les mutations altérant en cis les sites d’épissage représenteraient jusqu’à 30 % des mutations héritées [8].

Un cas emblématique de ce type d’altérations est celui des mutations du gène CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), qui sont à l’origine de la mucoviscidose. Deux cent vingt-huit mutations en cis affectent l’épissage du gène CFTR, soit 11,36 % de l’ensemble des 2 007 mutations de ce gène (selon la base de données cystic fibrosis mutation database). Ces mutations ont des effets phénotypiques variables (d’une atteinte majeure – poumons et système digestif – à une atteinte de sévérité très modérée, comme la seule agénésie¹ des canaux déférents) selon le type d’allèles touchés et le site [9].

Par ailleurs, plusieurs altérations en trans de la machinerie d’épissage ont été rapportées. Le premier exemple est illustré par le cas de l’amyotrophie spinale (SMA, spinal muscular atrophy), une maladie autosomique dominante caractérisée par une dégénérescence des motoneurones. Cette affection est due à des mutations du gène SMN1 (survival motor neuron 1) responsables d’une diminution d’abondance de la protéine SMN, impliquée dans l’assemblage des snRNP [10]. L’absence de SMN résulte en une altération globale du répertoire des snRNP avec de profondes conséquences sur l’activité de la machinerie d’épissage. Il existe un gène paralogue, SMN2, qui ne peut cependant pas complémenter le défaut du gène SMN1 en raison d’un polymorphisme C6T dans l’exon 7 responsable du saut de l’exon et conduisant à la synthèse d’une protéine instable (Figure 4A) [11].

Le second exemple porte sur la rétinite pigmentaire, une maladie génétique fréquente (avec une prévalence de 1/4 000) conduisant à une cécité progressive due à de nombreuses mutations distinctes avec une ségrégation essentiellement mendélienne, autosomique ou liée à l’X, récessive ou dominante. Certaines des mutations dominantes touchent des protéines du splicéosome, comme PRPF (pre-mRNA processing factor) 31, PRPF8, PRPF3 et hBRR2 (une hélicase essentielle pour l’épissage des pré-ARNm) en particulier (Figure 4B) [12]. Ces protéines sont impliquées dans l’assemblage ou le désassemblage du complexe tri-snRNP U4/U6.U5. La mutation c.2185C>T (correspondant à p.Arg729Trp sur la protéine) du gène PRPF6 est associée à un défaut d’assemblage du complexe du fait de la localisation nucléaire aberrante de la protéine dans les corps de Cajal, des sites où prennent place des modifications et l’assemblage de plusieurs snRNP [13]. L’épissage d’un ensemble d’introns dans les gènes MATN4 (matrilin 4), CBLN1 (cerebellin 1 precursor) ou AIP (aryl hydrocarbon receptor-interacting protein) est altéré, comme dans le cas de mutations d’autres gènes dont PRPF31, PRPF3, et PRPF8, indiquant que ces manifestations rétiniennes sont très sensibles à des altérations de la machinerie d’épissage.

Plusieurs autres pathologies affectant l’épissage en trans ont également été rapportées, dont une délétion du gène SF3B4 (splicing factor 3b subunit 4) associée au syndrome de Nager, une affection caractérisée par des dysostoses acrofaciales² [14], ou encore la Clericuzio-type poikiloderma, une maladie associée à un défaut de maturation du snARN U6 [15]. En outre, plusieurs mutations affectant le fonctionnement du splicéosome mineur ont été caractérisées dont celles à l’origine d’une déficience en hormone de croissance [16] ou d’une forme de nanisme affectant le gène MOPD I (microcephalic osteodysplastic primordial dwarfism) [17], ou encore de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) [18].

Au-delà des mutations germinales, un large ensemble de mutations acquises ont été identifiées, en particulier dans les cancers.

Les mutations de sites d’épissage survenues au niveau somatique sont relativement peu fréquentes dans les cancers [19], en comparaison des mutations germinales touchant des gènes de maladies génétiques, et d’incidence variable, plutôt faible dans le cancer du poumon [20]. Cependant, les sites d’épissage de l’exon 14 de l’oncogène MET sont souvent mutés dans les adénocarcinomes du poumon (3 %), conduisant à une exclusion de cet exon dans l’ARNm (Figure 4C) [21]. Dans les cancers, les mutations touchant des sites accessoires (ESE, ESS, etc.) seraient plus fréquentes que celles touchant des sites canoniques, à l’inverse des mutations germinales [22]. Au-delà des mutations en cis, les données de séquençage génomique à haut débit démontrent que les gènes codant des protéines d’épissage sont très fréquemment mutés, de sorte que chacun des 347 gènes intervenant dans les voies RNA splicing ou spliceosomal complex de la base de données Gene Ontology porte au minimum une mutation dans au moins un type de cancer [23], sans distribution spécifique selon les cancers. Certaines de ces mutations ont été décrites comme des mutations pilotes (drivers) oncogéniques. De façon remarquable, dans les syndromes myélodysplasiques (SMD), des hémopathies malignes pouvant évoluer en leucémie aiguë myéloïde (LAM), plus de la moitié des patients présentent une mutation acquise dans un gène codant une protéine d’épissage [24].

L’un des facteurs les plus fréquemment mutés est SF3B1 (splicing factor 3b subunit 1), dans 20 % des syndromes myélodysplasiques (SMD), et jusqu’à 80 % dans les formes sidéroblastiques, caractérisées par la présence de sidéroblastes en couronne dans la moelle osseuse³ [25] (→).

(→) Voir la Nouvelle de F. Damm et al., m/s n° 5, mai 2012, page 453

Parmi les gènes exprimés et/ou épissés différemment lorsque SF3B1 est muté, figurent plusieurs gènes impliqués dans la pathogenèse des SMD (ASXL1 [additional sex combs like 1] et CBL [casitas B-lineage lymphoma]), dans l’homéostasie du fer et le métabolisme mitochondrial (ALAS2 [5’-aminolevulinate synthase 2], ABCB7 [ATP binding cassette subfamily b member 7] et SLC25A37 [mitoferrin-1]) ou encore dans l’épissage ou la maturation des ARN (PRPF8 [pre-mRNA processing factor 8] et HNRNPD [heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D]) [26]. Le gène SF3B1 est également muté dans d’autres hémopathies myéloïdes, dans la leucémie lymphoïde chronique (10 à 15 %) [27], dans le mélanome uvéal (20 %) [28] et, à une moindre fréquence (4 %), dans les cancers du sein [29] et du pancréas [30]. De façon intrigante, seulement une fraction des événements d’épissage aberrants est commune aux différents cancers présentant une mutation de SF3B1 [31]. SF3B1 joue un rôle majeur dans la reconnaissance, par le splicéosome, du site 3’ accepteur d’épissage, en favorisant le recrutement de la sous-unité U2 snRNP sur l’ARN pré-messager ( Figure 1B et Figure 4D ). Des études de séquençage d’ARN (RNAseq) menées sur différents cancers [31] montrent que les mutations fréquentes de SF3B1 – toutes ciblées et faux sens – sont associées à la dérégulation d’un nombre restreint de jonctions d’épissage, pouvant conduire à la dégradation de certains de ces transcrits aberrants par la machinerie de contrôle qualité des ARNm (nonsense mediated mRNA decay). Ainsi, les mutations de SF3B1 « tromperaient le splicéosome » en permettant, quand la séquence intronique est favorable, l’utilisation d’un site de branchement alternatif en amont, conduisant à la sélection aberrante d’un site 3’ accepteur d’épissage cryptique (Figure 4D) [31]. Le nombre de transcrits variants reste cependant limité, car seuls les introns qui présentent certains déterminants de séquence semblent être les cibles de la forme altérée de SF3B1. L’impact fonctionnel de ces mutations dans le processus oncogénique nécessite encore d’être déterminé.

D’autres gènes de protéines d’épissage, ou de sa régulation, sont également affectés, notamment, dans les syndromes myélodysplasiques, les gènes U2AF1 (U2 small nuclear RNA auxiliary factor 1), ZRSF2 (U2 small nuclear ribonucleoprotein auxiliary factor 35 kDa subunit-related protein 2) et SRSF2 (serine/arginine-rich splicing factor 2) [32]. Les mutations dans certains de ces gènes, dont SF3B1 ou U2AF1, semblent jouer un rôle essentiel dans les étapes précoces de la maladie dans le cas, respectivement, de pathologies leucémiques ou d’adénocarcinomes du poumon [27, 33].

Plus largement, une analyse par fusion gene microarray menée sur 548 gènes de fusion – qui résultent de la fusion de gènes après translocations chromosomiques, les plus communes des altérations somatiques dans les cancers [19], a identifié plusieurs gènes de protéines d’épissage, dont DDX5 (DEAD-box helicase 5), FUS (fused in sarcoma), hnRNPA2B1 (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1), NONO (non-POU domain-containing octamer-binding protein) et SFPQ (splicing factor proline/glutamine-rich), suggérant l’existence d’altérations fonctionnelles dans les protéines correspondantes [34]. De plus, une étude récente a permis de mettre en évidence une surreprésentation (x 1,5) de mutations somatiques synonymes dans un ensemble de 16 oncogènes (parmi lesquels PDGFRA [platelet derived growth factor receptor alpha], EGFR [epidermal growth factor receptor], VEGFR2 [vascular endothelial growth factor receptor 2], NTRK1 [neurotrophic receptor tyrosine kinase 1], IL7R [interleukin 7 receptor], TSHR [thyroid stimulating hormone receptor], ELN [elastin], JAK3 [janus kinase 3], ITK [IL2 inducible T-cell kinase], GATA1 [GATA binding protein 1], RUNX1T1 [Runt-related transcription factor 1-translocation partner 1], ALK [anaplastic lymphoma kinase] et NOTCH2 [neurogenic locus notch homolog protein 2]), mais pas dans les gènes suppresseurs de tumeurs. La conséquence de ces mutations est une propension à augmenter les ESE et à diminuer les ESS [22]. Ceci est à rapprocher du fait que dans cet ensemble de gènes, les exons qui contiennent le plus de mutations synonymes ont également des sites d’épissage plus « faibles » que les autres exons. Une surreprésentation en ESE résultant de mutations doit donc conduire à une augmentation du taux d’inclusion de ces exons « faibles ». Néanmoins, il serait important de savoir si les mutations synonymes dans ces oncogènes présentent une spécificité vis-à-vis du type de cancer.

Par ailleurs, un ensemble d’altérations de la machinerie d’épissage, survenu au niveau somatique, a été identifié dans les maladies neuro-dégénératives, notamment les maladies d’Alzheimer et de Parkinson [35, 36].