Vignette (Photo © Inserm - Isabelle Maridonneau-Parini).

Les neutrophiles, ou polynucléaires neutrophiles (en anglais polymorphonuclear cells ou PMN) sont des cellules du système immunitaire inné jouant un rôle très important dans les défenses contre les pathogènes [ 1]. Ce sont les leucocytes les plus abondants dans la circulation sanguine, et leur nombre augmente très fortement et très rapidement lors d’infections. Les neutrophiles peuvent tuer les microorganismes par une multitude de mécanismes tels que la phagocytose, la libération d’enzymes qu’ils présentent au niveau de leurs granules cytoplasmiques (myéloperoxidase [MPO], élastase, protéinase-3, cathépsine G, etc.), ou de dérivés réactifs de l’oxygène (produits par la NADPH [nicotinamide adénine dinucléotide phosphate réduit] oxydase et la MPO), ou la formation de NET (neutrophil extracellular traps)^1, [1- 3] ➔.

➔ Voir la Synthèse de V. Granger et al., m/s n° 5, mai 2014, page 544

Certains produits libérés lors de l’activation des neutrophiles, et qui sont impliqués dans les défenses antimi-crobiennes, ont également des effets pro-inflammatoires puissants. Les neutrophiles peuvent ainsi contribuer aux dommages tissulaires dans le contexte d’une réponse immunitaire et participer à l’inflammation pathologique dans certaines maladies auto-immunes ou allergiques [ 4]. IIs sont aussi impliqués dans la résolution de l’inflammation via différents mécanismes [1, 5- 9] ➔.

➔ Voir la Synthèse de A. Chakravarti et al., m/s n° 10, octobre 2007, page 862; la Synthèse de A. Dumas et M. Pouliot, m/s 8-9, août-septembre 2009, page 699; la Nouvelle de F. Jönsson et al., m/s n° 10, octobre 2011, page 823

En effet, lors de la réponse inflammatoire, les neutrophiles apoptotiques sont éliminés par phagocytose par les macrophages qui subissent alors une modification de leur phénotype avec l’apparition de fonctions anti-inflammatoires [ 8]. Par ailleurs, l’utilisation de l’oxygène par la NADPH oxydase des neutrophiles induit, au niveau du site d’inflammation, une hypoxie à l’origine d’une réponse anti-inflammatoire par les cellules épithéliales [ 10]. Plusieurs de ces données récentes ont été obtenues grâce à la mise au point de nouveaux modèles rendant possible l’étude des différentes fonctions des neutrophiles. Même s’il est possible de les isoler et de les étudier in vitro, la grande plasticité phénotypique de ces cellules et leur capacité d’expansion et d’infiltration tissulaire rendent leur analyse in vivo nécessaire. De nombreux modèles murins ont donc été développés. Nous détaillerons dans une première partie les modèles les plus couramment utilisés avec leurs principaux avantages et limitations (Tableau I).

La plupart des modèles de souris neutropéniques ont été créés en utilisant une approche génétique visant à bloquer l’expression ou l’activité de la protéine Gfi-1 (growth factor independent-1), un répresseur de transcription qui favorise la différenciation des cellules souches hématopoïétiques en précurseurs de neutrophiles [ 19]. Les souris déficientes pour Gfi-1 (souris Gfi-1^-/-) présentent une forte neutropénie [20] mais aussi des anomalies de développement des cellules lymphoïdes. Ces animaux sont de taille réduite et ont une espérance de vie diminuée par rapport aux souris sauvages [ 21, 22]. Les souris Genista présentent une mutation ponctuelle dans le gène Gfi-1. Elles sont déficientes en neutrophiles mais, contrairement aux souris Gfi-1^-/-, leur croissance est normale, et elles ne présentent pas de problèmes majeurs au niveau des cellules lymphoïdes [23]. Ces souris possèdent cependant une sous-population de neutrophiles dits « atypiques » ayant un phénotype intermédiaire entre neutrophiles matures et immatures, qui sont capables d’induire certaines réponses inflammatoires mais ne protègent pas des infections bactériennes [23]. Clausen et al. [24] ont généré une souris transgénique ayant une délétion ciblée du gène codant Mcl-1 (myeloid cell leukemia 1), un facteur anti-apoptotique de la famille de Bcl-2 (B-cell lymphoma 2), dans toutes les cellules myéloïdes (les souris LysM^Cre; Mcl-1^flox, également appelées Mcl-1^ΔMyelo) [24, 25]. De manière surprenante, même si ce facteur de survie est absent de toutes les cellules myéloïdes de ces souris, seule la population de neutrophiles semble être affectée, les niveaux de monocytes, macrophages et cellules dendritiques étant normaux [24, 25]. Une étude plus approfondie reste cependant nécessaire avant de pouvoir conclure sur la sélectivité de ce modèle de souris neutropéniques.

Les cellules de souris sont 10 000 fois plus résistantes aux effets de la toxine diphtérique (DT) que les cellules humaines, car elles n’expriment pas le récepteur de la toxine (DTR) permettant sa pénétration dans les cellules. Plusieurs laboratoires ont généré des modèles de souris transgéniques exprimant le récepteur DTR dans un type de cellules, dans lesquels une injection de DT permet d’éliminer sélectivement la population cellulaire présentant le récepteur [ 26]. Cependant, cette démarche n’avait jamais été appliquée aux neutrophiles.

Nous avons récemment généré une souris transgénique exprimant le DTR uniquement dans les neutrophiles. Nous avons utilisé les souris hMrp8^Cre, qui expriment l’enzyme CRE recombinase sous la dépendance du promoteur du gène humain hMrp8 (human myeloid-related protein) [ 27], qui est exprimé de manière sélective dans les neutrophiles chez la souris. Ces souris ont été croisées avec une lignée de souris chez laquelle l’expression du DTR humain peut être induite par la CRE recombinase (les souris iDTR ^fl/fl), obtenant ainsi une lignée exprimant le DTR dans les neutrophiles (souris hMrp8 ^Cre; iDTR ^flox), que nous avons nommées PMN ^DTR [28].

L’injection de DT aux souris PMN ^DTR provoque l’élimination de plus de 90 % des neutrophiles dans le sang, la rate et la moelle osseuse, sans aucun effet sur d’autres types de cellules immunitaires, à l’exception d’une diminution du nombre de monocytes circulants [28]. Chez ces souris, la population de neutrophiles peut être restaurée de manière sélective par transfert adoptif de neutrophiles purifiés, ce qui est impossible avec les anticorps déplétants (ces anticorps éliminant en effet les neutrophiles transférés).

Des expériences de transferts adoptifs de neutrophiles fluorescents (purifiés à partir de souris exprimant de manière constitutive la protéine fluorescente YFP [yellow fluorescent protein]) ont montré que, dans les souris PMN^DTR, la déplétion des neutrophiles endogènes créait une niche favorable à l’implantation de neutrophiles exogènes. On retrouve ainsi, 4 h après le transfert adoptif, une quantité plus importante de neutrophiles fluorescents (YFP⁺) dans le sang des souris PMN ^DTR rendues neutropéniques par injection de DT que dans celui des souris contrôles (présentant encore des neutrophiles endogènes) [28]. Les souris PMN ^DTR représentent donc un nouveau modèle de neutropénie inductible et réversible.

Bien que les neutrophiles représentent une importante barrière immunitaire pour combattre les bactéries, il est généralement accepté qu’ils contribuent également à l’inflammation et aux dommages tissulaires induits par certains produits bactériens comme le lipopolysaccharide (LPS, une endotoxine présente à la surface des bactéries Gram négatif). Les souris déficientes en myéloperoxydase (MPO), la principale enzyme produite par les neutrophiles, développent ainsi une inflammation pulmonaire, après injection intranasale de LPS, qui est diminuée par rapport celle observée chez des souris sauvages [ 29]. De même, les souris déficientes pour l’élastase des neutrophiles ont une inflammation et une mortalité réduites après injection intrapéritonéale de l’endotoxine [ 30]. Les neutrophiles et en particulier la MPO, sont ainsi souvent utilisés comme marqueur d’inflammation dans des modèles murins en réponse au LPS (modèles de choc endotoxinique). L’utilisation des souris PMN^DTR a cependant permis de révèler qu’au contraire, les neutrophiles peuvent avoir un effet protecteur, la neutropénie induite chez ces souris se traduisant par une très importante augmentation de l’inflammation et de la mortalité des animaux en réponse au LPS [28] (Figure 1). La MPO a également un effet protecteur dans le choc endotoxinique. Une déficience en MPO se traduit en effet par une forte augmentation de l’inflammation et de la mortalité des animaux en réponse au LPS [28]. La repopulation des souris PMN ^DTR rendue neutropéniques par injection de DT, avec des neutrophiles isolés de souris sauvages, permet d’augmenter la survie dans ce modèle de choc endotoxinique, ce qui n’est pas le cas si le transfert est réalisé avec des neutrophiles provenant de souris déficientes pour la MPO. L’ensemble de ces résultats obtenus avec ce nouveau modèle a ainsi permis d’identifier un nouveau mécanisme de protection impliquant les neutrophiles et la MPO, leur principale enzyme.

Figure 1 Figure 1. Exemple d’utilisation du modèle PMNDTR : démonstration du rôle protecteur des neutrophiles et de leur enzyme MPO contre le LPS. A. L’injection de toxine diphtérique (DT) induit une élimination sélective des neutrophiles chez les souris PMN DTR mais pas chez les souris contrôles PMNWT. B. La population de neutrophiles peut être restaurée de manière sélective chez les souris PMN DTR par transfert adoptif de neutrophiles purifiés à partir de moelle osseuse de souris sauvages ou génétiquement modifiées (dans notre étude, des souris déficientes en MPO [Mpo -/-] [28]). C. Le rôle des neutrophiles et de certains produits qu’ils libèrent (ici la MPO), dans des modèles de pathologie (ici le choc endotoxinique) est étudié en comparant les réponses de souris PMN WT et PMN DTR reconstituées ou non avec des neutrophiles. Dans notre étude, les groupes de souris déficientes en neutrophiles PMN DTR et de souris PMN DTR reconstituées avec des neutrophiles Mpo -/- sont beaucoup plus susceptibles aux effets toxiques du LPS que les souris contrôles PMNWT et les souris PMN DTR reconstituées avec des neutrophiles sauvages. Ces expériences ont conduit à la conclusion que les neutrophiles et leur enzyme MPO avaient un rôle protecteur contre les effets toxiques du LPS [28]. WT : sauvage; DTR : récepteur de la toxine diphtérique; LPS : lipopolysaccharide (une endotoxine présente à la surface des bactéries Gram négatif); MPO : myéloperoxidase; PMN : polynucléaire neutrophile.

Figure 1 Figure 1. Exemple d’utilisation du modèle PMNDTR : démonstration du rôle protecteur des neutrophiles et de leur enzyme MPO contre le LPS. A. L’injection de toxine diphtérique (DT) induit une élimination sélective des neutrophiles chez les souris PMN DTR mais pas chez les souris contrôles PMNWT. B. La population de neutrophiles peut être restaurée de manière sélective chez les souris PMN DTR par transfert adoptif de neutrophiles purifiés à partir de moelle osseuse de souris sauvages ou génétiquement modifiées (dans notre étude, des souris déficientes en MPO [Mpo -/-] [28]). C. Le rôle des neutrophiles et de certains produits qu’ils libèrent (ici la MPO), dans des modèles de pathologie (ici le choc endotoxinique) est étudié en comparant les réponses de souris PMN WT et PMN DTR reconstituées ou non avec des neutrophiles. Dans notre étude, les groupes de souris déficientes en neutrophiles PMN DTR et de souris PMN DTR reconstituées avec des neutrophiles Mpo -/- sont beaucoup plus susceptibles aux effets toxiques du LPS que les souris contrôles PMNWT et les souris PMN DTR reconstituées avec des neutrophiles sauvages. Ces expériences ont conduit à la conclusion que les neutrophiles et leur enzyme MPO avaient un rôle protecteur contre les effets toxiques du LPS [28]. WT : sauvage; DTR : récepteur de la toxine diphtérique; LPS : lipopolysaccharide (une endotoxine présente à la surface des bactéries Gram négatif); MPO : myéloperoxidase; PMN : polynucléaire neutrophile.

Les souris PMN^DTR représentent un nouveau modèle important pour l’étude des neutrophiles in vivo, avec des avantages significatifs par rapport aux modèles existants. La déplétion obtenue dans ce modèle est en effet spécifique et transitoire. Le repeuplement sélectif des neutrophiles peut être réalisé à partir de polynucléaires isolés de souris sauvages mais également de souris génétiquement modifiées afin d’étudier le rôle de certains gènes dans les fonctions de ces cellules. Cet outil nous a ainsi permis de révéler le rôle protecteur des neutrophiles et de leur enzyme MPO dans le choc endotoxinique [28]. Il devrait permettre l’identification de nombreuses autres fonctions de ces cellules dans l’immunité innée et adaptative.

Les auteurs déclarent n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article.