La cytométrie, déjà connue dans les années 1930, ne prend réellement son essor que vers la fin des années 1960 avec les travaux de Kamentsky, en 1965 et 1967 [ 1, 2]. Les progrès dans la détection et le traitement du signal lumineux ont alors permis à l’équipe d’Herzenberg (1931-2013) de développer le premier cytomètre ayant une fonction de tri permettant la séparation de cellules d’intérêt grâce à un système de formation de gouttelettes reprenant le même principe que l’imprimante à jet d’encre [ 3]. C’est ce principe qui a été appliqué avec de nombreuses améliorations ces dernières décennies.

La cytométrie en flux, dont le nom en grec signifie « mesure de cellules » en flux, est une technique biologique qui permet l’étude multiparamétrique précise, quantitative et qualitative, de particules isolées en suspension entraînées par un flux liquide. Son expansion et son succès sont indissociables de la production d’anticorps monoclonaux, découverte par Köhler et Milstein en 1975 [ 4], et de la possibilité d’y fixer de façon covalente différentes molécules fluorescentes, comme l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) dès 1950 [ 5], auxquelles il faut leur adjoindre de nombreuses sondes fonctionnelles synthétisées notamment sous l’égide de R. Haughland [ 6]. La cytométrie en flux est aujourd’hui omniprésente, aussi bien utilisée dans les laboratoires d’analyses médicales que dans les laboratoires de recherche. On la retrouve également embarquée sur des navires, voire des bouées, pour des études de biologie marine dans lesquelles les pigments naturels des micro-organismes sont les principaux critères d’identification et quantification des populations.

Ces dernières années ont vu une progression importante des capacités des nouveaux appareils. La cytométrie en flux actuelle permet une collection plus importante de données et donc, des analyses plus fines et parfois plus rapides. Un saut technologique a été récemment franchi avec la cytométrie couplée à la spectrométrie de masse, dans laquelle les fluorochromes ont été remplacés par des métaux rares de la famille des lanthanides qui possède de nombreux isotopes non radioactifs de masse moléculaire différente, élargissant ainsi considérablement les possibilités de détections simultanées. Dans cette revue, nous décrirons schématiquement la cytométrie en flux conventionnelle ainsi que deux des technologies récemment développées : l’analyse spectrale et la cytométrie de masse.

La cytométrie conventionnelle regroupe (1) un système fluidique entraînant des particules monodispersées, comme des cellules, une à une jusqu’à une, ou des, source(s) d’excitation, (2) un système de collection de la lumière émise (fluorescence), (3) une digitalisation du signal, et (4) un logiciel d’analyse permettant d’interpréter les données. Deux systèmes fluidiques existent. Ils reposent sur la circulation d’un liquide de gaine entraînant les particules jusqu’au site où elles seront analysées (la cuvette d’analyse) (Figure 1). Dans le cas de la focalisation hydrodynamique, une pression légèrement supérieure à celle du liquide de gaine est appliquée à l’échantillon pour permettre la pénétration des particules dans le flux. Cette stratégie favorise l’alignement des particules, les unes derrière les autres, à l’entrée de la chambre d’analyse. Cependant, lorsque la pression appliquée sur l’échantillon est augmentée pour accélérer la vitesse d’analyse, le flux de particules s’élargit. Celles-ci se distribuent alors plus aléatoirement dans le cœur du fluide, ce qui affecte l’homogénéité de l’excitation et de la collecte des signaux. Cela peut également permettre à plusieurs particules de traverser le faisceau laser au même moment (Figure 1A). Une variation de signal, qui dégrade la qualité de l’analyse, est alors observée. Ce problème a été résolu avec la focalisation acoustique (Attune NxT Flow cytometer, développé par ThermoFischer scientific). Grâce à une sonde de sonication adjointe à l’entrée de la cuvette d’analyse (Figure 1B), le flux devient indépendant de la pression exercée et les particules s’alignent sur le cœur du fluide, recevant alors la même excitation par les faisceaux lasers. Cette amélioration autorise des vitesses de passage de cellules beaucoup plus importantes, de l’ordre de 5 à 10 fois par rapport à la focalisation hydrodynamique (50 000 événements par seconde) et sans perte de qualité du signal.

Figure 1. Système fluidique. Comparaison des focalisations hydrodynamique (A) et acoustique (B). Le différentiel de pression entre le liquide de gaine et le liquide d’échantillon forme un jet plus ou moins large qui entraîne les particules vers le faisceau laser. Lorsque la vitesse, et donc la pression appliquée à l’échantillon, est faible, le jet est étroit (cellules jaunes). Il s’élargit lorsque la pression augmente (cellules rouges). Les histogrammes montrent les résultats obtenus dans chaque condition : l’étroitesse du pic reflète la qualité de la mesure du signal.

Figure 1. Système fluidique. Comparaison des focalisations hydrodynamique (A) et acoustique (B). Le différentiel de pression entre le liquide de gaine et le liquide d’échantillon forme un jet plus ou moins large qui entraîne les particules vers le faisceau laser. Lorsque la vitesse, et donc la pression appliquée à l’échantillon, est faible, le jet est étroit (cellules jaunes). Il s’élargit lorsque la pression augmente (cellules rouges). Les histogrammes montrent les résultats obtenus dans chaque condition : l’étroitesse du pic reflète la qualité de la mesure du signal.

Les sources d’excitation ont aussi grandement évolué : les lampes à arc initialement utilisées ont été remplacées par des lasers à gaz, puis des lasers solides, et plus récemment, des diodes lasers. Aujourd’hui, les sources les plus communes sont les lasers violet (405 nm), bleu (laser argon, 488 nm) et rouge (633 nm), ainsi que les lasers jaune/vert (561 nm) et ultraviolet (355 nm).

Une particule traversant le faisceau laser diffuse la lumière de ce faisceau. Ses propriétés de diffusion, selon l’axe du laser et à 90°, permettent d’évaluer sa taille et sa structure. La mesure des intensités de fluorescences émises à la suite de l’excitation par la particule repose sur des composants optiques. L’enchaînement de miroirs dichroïques et de filtres permet de morceler le spectre de la lumière émise, en fonction des maximums des pics d’émission des différentes molécules fluorescentes de l’échantillon (Figure 2A). Cette approche permet de collecter, sur un détecteur spécifique, le maximum d’émission d’une fluorescence (Figure 2C). Ainsi, suite à une excitation par le laser à 488 nm, un miroir dichroïque passe-haut 560 nm réfléchira les longueurs d’ondes inférieures à 560 nm, et transmettra celles qui sont supérieures. Des filtres passe-bandes (BP) sont également positionnés devant chaque détecteur et collectent la lumière entre deux longueurs d’ondes. Par exemple, un filtre BP 530/30 transmettra la lumière entre 515 et 545 nm, spécifique de l’émission du fluorochrome FITC exité à 488 nm, sur le détecteur A (Figure 2B et C). Une perte de photons peut apparaître selon la largeur de la bande et l’efficacité de transmission spécifique à chaque filtre. Les détecteurs sont principalement des tubes photomultiplicateurs très sensibles qui transforment les photons collectés en un signal électrique amplifié. Dans le cas où deux fluorochromes ont des spectres d’émission qui se chevauchent, un tube photomultiplicateur détectera les photons émis par deux molécules. Ces photons parasites induisent un biais d’analyse. Il est donc indispensable de corriger cette fuite spectrale afin de pouvoir mesurer la fluorescence spécifique de la molécule d’intérêt. Dans ce cas, une soustraction mathématique est possible grâce à l’utilisation de matrices de compensation, aujourd’hui automatisable. Cette étape indispensable et cruciale dans le réglage du cytomètre requiert des échantillons contrôles adaptés, appelés « mono-marqués », qui permettent d’évaluer cette fuite spectrale sur chaque détecteur. Les signaux électriques recueillis sont ensuite digitalisés. Les données obtenues peuvent être analysées avec des logiciels dédiés.

Figure 2. Cytométrie conventionnelle. A. Schéma des spectres d’excitation (lignes) et des spectres d’émission (aires) de plusieurs fluorochromes entre 300 et 800 nm en fonction des lasers bleu (488 nm), vert/jaune (561 nm) et violet (405 nm). B. Comparaison des spectres d’émission de 4 fluorochromes. Les rectangles représentent la fenêtre de longueurs d’ondes des différents filtres bande-passe utilisés classiquement sur les cytomètres pour collecter les photons émis par chaque sonde sur son détecteur spécifique. Les traits en pointillés verticaux représentent les possibilités des contaminations croisées des différents fluorochromes sur chacun des autres détecteurs. C. Schéma simplifié d’un cytomètre. Le schéma montre un cytomètre possédant 3 lasers (violet, bleu et vert/jaune) décalés dans l’espace dont les faisceaux rencontrent un flux de cellules marquées par des fluorochromes différents. Plusieurs jeux de miroirs et de filtres dichroïques permettent d’adresser les fluorescences émises sur les détecteurs dédiés. Les graphiques montrent le cas d’une étude de cycle et d’apoptose sur des cellules non fixées en l’absence (panneau de gauche) ou en présence (panneau de droite) d’un inducteur de mort cellulaire (V : cellules vivantes ; M : cellules mortes ou en apoptose).

Figure 2. Cytométrie conventionnelle. A. Schéma des spectres d’excitation (lignes) et des spectres d’émission (aires) de plusieurs fluorochromes entre 300 et 800 nm en fonction des lasers bleu (488 nm), vert/jaune (561 nm) et violet (405 nm). B. Comparaison des spectres d’émission de 4 fluorochromes. Les rectangles représentent la fenêtre de longueurs d’ondes des différents filtres bande-passe utilisés classiquement sur les cytomètres pour collecter les photons émis par chaque sonde sur son détecteur spécifique. Les traits en pointillés verticaux représentent les possibilités des contaminations croisées des différents fluorochromes sur chacun des autres détecteurs. C. Schéma simplifié d’un cytomètre. Le schéma montre un cytomètre possédant 3 lasers (violet, bleu et vert/jaune) décalés dans l’espace dont les faisceaux rencontrent un flux de cellules marquées par des fluorochromes différents. Plusieurs jeux de miroirs et de filtres dichroïques permettent d’adresser les fluorescences émises sur les détecteurs dédiés. Les graphiques montrent le cas d’une étude de cycle et d’apoptose sur des cellules non fixées en l’absence (panneau de gauche) ou en présence (panneau de droite) d’un inducteur de mort cellulaire (V : cellules vivantes ; M : cellules mortes ou en apoptose).

Recueillir l’ensemble du spectre émis par un fluorochrome lors de son passage devant le faisceau laser a été une problématique complexe et longue à résoudre. Elle a débouché sur la cytométrie spectrale, qui permet un échantillonnage du spectre à haute résolution. En 2012, Grégori et al. ont proposé un prototype de cytomètre spectral dans lequel la fluorescence émise était divisée en deux afin d’être soit analysée classiquement, soit dispersée par différents systèmes optiques avant d’être dirigée vers un tube photomultiplicateur multi-anode mesurant l’ensemble du spectre de fluorescence [ 7].

Principe de la cytométrie spectrale

Le premier cytomètre en flux utilisant la technologie d’analyse spectrale a été commercialisé en 2014 (sous le nom de SP6800 par SONY Biotechnologies). Un schéma descriptif de ce cytomètre est présenté dans la Figure 3A. Dans la chambre d’analyse (Figure 3C), les cellules sont soumises séquentiellement à un laser 488 nm puis à la combinaison de deux lasers 405 et 638 nm. L’optique de séparation spectrale est composée de dix prismes. Ils étalent la fluorescence émise entre 500 et 800 nm et la dirige vers une série de lentilles qui concentrent la lumière sur un photomultiplicateur. Une meilleure résolution des émissions de nombreuses sondes et protéines fluorescentes, qui émettent dans le bleu et le vert, peut être obtenue en augmentant le nombre de canaux dans ces longueurs d’ondes (Figure 3B). Deux photomultiplicateurs détectent les fluorescences émises entre 420-440 nm (FL1) et 450-469 nm (FL2) pour les sondes excitables à 405 nm. Les propriétés optiques de diffusion (taille et structure) sont collectées sur des photodiodes (Figure 3A). Des graphiques qui représentent l’intensité du signal en fonction de la longueur d’onde d’émission pour chaque série de laser permettent de visualiser les spectres de fluorescences. Un filtre bloque la lumière du laser rouge (Figure 3D, flèches rouges) et crée un « trou » dans le spectre autour de 638 nm.

Figure 3. Cytométrie spectrale. Les spectres présentés sont obtenus pour une excitation à 488 nm, excepté lorsque cela est précisé. A. Schéma optique d’un cytomètre spectral (SONY SP6800). B. Longueurs d’ondes détectées par chacun des canaux du photomultiplicateur (PMT) 32 canaux. C. Chambre de détection. D. Spectres de billes fluorescentes excitées par le laser 488 nm (gauche) et 405/ 638 nm (droite). L’axe des abscisses correspond aux longueurs d’ondes, l’ordonnée à l’intensité de fluorescence. La couleur indique la quantité de fluorescence dans chaque canal (rouge, forte ; vert, moyenne ; bleue, faible). Les flèches rouges indiquent le filtre qui masque la lumière du laser 638 nm. E. Filtre virtuel phycoérythrine (PE) appliqué aux billes. F. Empreinte spectrale de l’échantillon (S[5λ]) et spectres individuels mesurés (fluorescéine [FITC] en vert, PE en orange et bruit de fond des cellules en violet). Le rectangle gris représente le masque obstruant la lumière du laser 638 nm. G. Graphiques de gauche : spectres des cellules marquées avec le mélange des anticorps couplés au FITC et au PE. Spectres de références individuels, du FITC et PE, qui seront utilisés par l’algorithme pour la décomposition spectrale. Graphiques de droite : Visualisation des cellules en nuages de points de densité avant et après application de l’algorithme de décomposition spectrale. H. Identification des cellules auto-fluorescentes à partir de l’échantillon non marqué. Spectres des cellules non auto-fluorescentes (NON AF) et auto-fluorescentes (AF). Utilisation de l’auto-fluorescence comme un paramètre après décomposition spectrale (d’après [ 11], avec l’autorisation de SONY Biotechnologies Inc).

Figure 3. Cytométrie spectrale. Les spectres présentés sont obtenus pour une excitation à 488 nm, excepté lorsque cela est précisé. A. Schéma optique d’un cytomètre spectral (SONY SP6800). B. Longueurs d’ondes détectées par chacun des canaux du photomultiplicateur (PMT) 32 canaux. C. Chambre de détection. D. Spectres de billes fluorescentes excitées par le laser 488 nm (gauche) et 405/ 638 nm (droite). L’axe des abscisses correspond aux longueurs d’ondes, l’ordonnée à l’intensité de fluorescence. La couleur indique la quantité de fluorescence dans chaque canal (rouge, forte ; vert, moyenne ; bleue, faible). Les flèches rouges indiquent le filtre qui masque la lumière du laser 638 nm. E. Filtre virtuel phycoérythrine (PE) appliqué aux billes. F. Empreinte spectrale de l’échantillon (S[5λ]) et spectres individuels mesurés (fluorescéine [FITC] en vert, PE en orange et bruit de fond des cellules en violet). Le rectangle gris représente le masque obstruant la lumière du laser 638 nm. G. Graphiques de gauche : spectres des cellules marquées avec le mélange des anticorps couplés au FITC et au PE. Spectres de références individuels, du FITC et PE, qui seront utilisés par l’algorithme pour la décomposition spectrale. Graphiques de droite : Visualisation des cellules en nuages de points de densité avant et après application de l’algorithme de décomposition spectrale. H. Identification des cellules auto-fluorescentes à partir de l’échantillon non marqué. Spectres des cellules non auto-fluorescentes (NON AF) et auto-fluorescentes (AF). Utilisation de l’auto-fluorescence comme un paramètre après décomposition spectrale (d’après [ 11], avec l’autorisation de SONY Biotechnologies Inc).

Si un échantillon cellulaire est marqué par deux anticorps, l’un étant couplé au FITC (vert) et l’autre à la PE (phycoérythrine, rouge), pour identifier deux populations distinctes, le signal mesuré (Figure 3F, courbe S(l) en pointillés bleus) se résumera en la somme de la fluorescence émise par les anticorps couplés au FITC (Figure 3F, courbe verte), au PE (Figure 3F, courbe orange), et au bruit de fond, provenant des cellules elles-mêmes (Figure 3F, courbe violette). Un algorithme mathématique de décomposition linéaire permet de déduire l’abondance de chacune des sondes à partir de l’empreinte spectrale de l’échantillon multi-marqué (Figure 3F, graphique de gauche) et des spectres de référence de chacune des molécules fluorescentes utilisées (FITC et PE dans notre exemple, Figure 3G, graphiques au centre). Une fois appliqué aux données brutes, une intensité de fluorescence est attribuée à chaque marqueur pour chaque cellule (Figure 3G, les deux nuages de points à droite) [ 8]. Ainsi, après l’acquisition des échantillons, puis application de la décomposition spectrale, les données obtenues peuvent être analysées.

À la différence de la cytométrie en flux conventionnelle ou spectrale, qui reposent sur la fluorescence, la cytométrie de masse (CMM), qui a émergé dans les années 2010 [ 12, 13], repose sur une analyse de la masse atomique des molécules [ 14] (→).

(→) Voir la Nouvelle de A. Cosma et R. Le Grand, m/s n° 12, décembre 2011, page 1072

Les sondes utilisées sont des anticorps, non plus couplés à des fluorochromes, mais à des isotopes de métaux non radioactifs de la famille des lanthanides¹. Ces isotopes étant absents des systèmes biologiques, leur détection révèle la fixation de l’anticorps à l’antigène recherché.

Méthode

Les étapes de préparation cellulaire et de marquage sont identiques à celles de la cytométrie en flux conventionnelle avec quelques nuances. Du cisplatine (ou du rhodium) est utilisé pour évaluer la viabilité des cellules^2,. Un intercalant d’acide nucléique conjugué à l’iridium permet d’analyser la teneur en ADN³. L’échantillon, fixé en suspension dans l’eau, est introduit dans une chambre remplie d’argon qui fournit la pression nécessaire pour le transférer au nébuliseur. L’eau sera ainsi éliminée par aérosolisation afin que l’échantillon soit ionisé dans le plasma. L’évaporation partielle des gouttelettes d’aérosols monocellulaires sera ensuite réalisée à travers une chambre de pulvérisation chauffée à 200 degrés. Les gouttelettes sortant de la chambre sont vaporisées, atomisées et ionisées pour une analyse de masse. Chaque cellule forme un nuage d’ions contenant les marqueurs métalliques ionisés. Les nuages sont envoyés dans l’analyseur de masse/temps de vol (TOF), qui sépare les ions sur la base du rapport masse-charge. Le faisceau sortant pénètre dans une chambre d’accélérateur d’analyseur TOF. L’analyse des données nécessite des logiciels qui ont initialement été adaptés à partir de la cytométrie classique, mais aussi des applications qui ont été développées pour de l’analyse en clustering [ 16] en raison du nombre croissant de données acquises (Figure 4).

Figure 4. Principe de la cytométrie de masse. Les cellules monodispersées sont marquées avec les anticorps ainsi qu’un intercalant de l’ADN conjugué à l’iridium. L’échantillon est introduit dans le nébuliseur, puis la chambre à plasma où il est vaporisé, atomisé et ionisé. Chaque nuage d’ions, correspondant à une cellule, est envoyé dans la chambre de vol pour la séparation des marqueurs métalliques en fonction de leur masse. Les ions sont détectés, puis analysés.

Figure 4. Principe de la cytométrie de masse. Les cellules monodispersées sont marquées avec les anticorps ainsi qu’un intercalant de l’ADN conjugué à l’iridium. L’échantillon est introduit dans le nébuliseur, puis la chambre à plasma où il est vaporisé, atomisé et ionisé. Chaque nuage d’ions, correspondant à une cellule, est envoyé dans la chambre de vol pour la séparation des marqueurs métalliques en fonction de leur masse. Les ions sont détectés, puis analysés.

Le « big bang » représenté par le développement de la masse en cytométrie a forcé les fabricants de lumières à se remettre sur la table à dessin et à revoir leurs palettes de couleurs. On ne peut que se réjouir de ces avancées en cytométrie conventionnelle, notamment en ce qui concerne la miniaturisation des appareils, grâce à l’utilisation de lasers solides, de fibres optiques, et de nouveaux détecteurs, et la synthèse de nouveaux fluorochromes. Cette technologie permet d’explorer le monde du vivant, des anomalies génétiques aux petits organismes, des microparticules aux organelles, en passant par la transduction du signal et l’activité enzymatique. Ces différentes approches que permet la cytométrie sont déjà et continueront d’être complémentaires (Tableau I).

La cytométrie spectrale permet, quant à elle, la discrimination de sondes présentant un important recouvrement spectral, et la gestion de l’autofluorescence des particules analysées, augmentant ainsi la sensibilité de détection. L’empreinte spectrale de chaque cellule devient une donnée indispensable à la compréhension de l’échantillon, voire à l’interprétation des résultats, en particulier dans le cas de la détection d’événements rares. Le champ d’application de cette technologie est vaste : immunologie, cancérologie, océanographie. Le tri cellulaire sur la base de l’analyse spectrale est la prochaine évolution de cette approche.

La cytométrie de masse a révolutionné la cytométrie en permettant d’analyser tous les compartiments cellulaires, de la membrane au contenu en ADN. Elle permet, par sa capacité analytique, de produire des données inégalables à toute autre technologie. Son absence d’autofluorescence est un immense avantage, permettant ainsi de mettre en évidence des événements rares. En revanche, la CMM ne peut, actuellement, utiliser des sondes fonctionnelles ou des substrats enzymatiques, et n’offre aucune possibilité de tri cellulaire. La CMM a permis le développement de logiciels de traitements de données qui peuvent désormais être utilisés par tous les cytométristes. L’évolution de la cytométrie de masse en analyse d’images va révolutionner la pertinence analytique des coupes tissulaires ; cette avancée technologique est très attendue dans le monde de la cancérologie [ 17].

Les années à venir devraient voir l’apparition de nouvelles technologies comme la microfluidique, qui permettraient d’explorer d’autres univers, comme les propriétés physiques des cellules. Il faut juste attendre qu’elles sortent de l’ombre [17].

Les auteurs déclarent n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article.