La purification par affinité, et notamment par immuno-affinité, est une des stratégies les plus couramment utilisées pour identifier les partenaires d’une protéine d’intérêt. Elle consiste, à partir d’un lysat cellulaire plus ou moins complexe, en la purification d’une protéine d’intérêt associée à ses partenaires à l’aide d’un anticorps spécifique [1] (Figure 1). Le lysat protéique peut être obtenu à partir de cellules en culture ou d’extraits tissulaires en utilisant des conditions de lyses douces et non-dénaturantes essentielles pour préserver au mieux les IPP. Un anticorps dirigé spécifiquement contre la protéine d’intérêt est ajouté au lysat cellulaire. Le complexe protéines-anticorps est ensuite purifié à l’aide de billes de sépharose couplées aux protéines A ou G, lesquelles possèdent une très forte affinité pour la région Fc des immunoglobulines G (IgG) utilisées. Une série de lavage avec une stringence plus ou moins forte permet d’éliminer d’éventuels faux positifs¹. Les complexes protéiques sont ensuite élués des billes en utilisant différents tampons variant en fonction des analyses ultérieures : western-blot ou ELISA pour confirmer des interactions supposées, et spectrométrie de masse pour identifier plus largement les protéines constituant les complexes purifiés [2]. La grande popularité de cette technique a conduit à sa large utilisation et à la publication d’articles majeurs décryptant les réseaux d’interactions protéine-protéine à l’échelle entière du protéome, et notamment humain (Tableau I). Ces articles ont mis à disposition une quantité massive de données utilisées par l’ensemble de la communauté scientifique et ont été à l’origine d’avancées majeures des connaissances en biologie [3-5].

Table I. Approche Complexes protéiques, compartiments ou fonctions cellulaires ciblés Protéine d’intérêt Nombre d’interacteurs uniques identifiés Nombre moyen d’interacteurs identifiés par protéine Nombre d’interactions identifiées Réf AP-MS Tout compartiment 338 2 235 7 6 463 [4] Tout compartiment 1 092 11 485 11 NA [51] Tout compartiment 1 125 5 400 5 28500 [3] Tout compartiment 2 594 7 668 3 23744 [6] Tout compartiment 5 891 10961 2 56553 [5] Y2H Tout compartiment 7 200 1 549 NA 2 754 [52] Tout compartiment 4 456 5 632 NA 3 269 [53] Signalisation cellulaire 473 1 126 NA 2 626 [54] Protéines hépatiques 5 026 3 484 NA 2 582 [55] Tout compartiment 15517 4 303 NA 13944 [56] BioID Voie de signalisation Hippo 19 337 18 487 [22] Cils cellulaires 58 1 774 31 7 092 [23] Histone et complexe Mediator 5 452 90 543 [57] Facteur de transcription SOX2 82 82 82 [24] Transport nucléo-cytoplasmique 16 1 252 78 ND [58] Granules de stress et P-bodies asso- ciés à l’ARN 119 1 792 15 7 424 [59] APEX Matrice mitochondriale Peptide signal 495 NA 495 [35] Espace intermembranaire mitochon- drial Peptide signal 127 NA 127 [40] Jonction RE-MP STIM1 38 38 38 [60] Cils cellulaires NPHP3 162 162 622 [61] Granules de stress G3BP1 123 123 123 [37] Sélection d’études d’interactomes. Comparativement aux techniques d’AP-MS et de Y2H, le BioID et l’APEX permettent d’identifier plus largement les interacteurs de protéines d’intérêt. AP-MS : affinity purification-mass spectrometry ; APEX : engineered ascorbate peroxidase ; BioID : proximity-dependent biotinylation identification ; NA : non applicable ; ND : non disponible ; RE-MP : réticulum endoplasmique-membrane plasmique ; Y2H : yeast-two-hybrid ; STIM1 : stromal interaction molecule 1 ; NPHP3 : nephrocystin 3 ; G3BP1 : G3BP stress granule assembly factor 1 ; SOX2 : SRY (sex-determining region Y)-box 2.

Cette approche présente un certain nombre d’avantages (Tableau II). Grâce aux conditions de lyse douce, il est possible de purifier la protéine d’intérêt et ses interacteurs dans des conditions quasi physiologiques, dans leur conformation native et en préservant leurs modifications post-traductionnelles. Par des analyses séquentielles, il est également possible d’étudier les IPP au cours du temps en réponse, par exemple, à un stimulus. La relative simplicité de sa mise en œuvre en fait une approche de choix pour caractériser les réseaux d’interactions protéiques des cellules eucaryotes et pour en révéler toute l’étendue et la complexité [3, 6]. Parmi les inconvénients des approches de purification par immuno-affinité, on peut noter qu’elles ne permettent pas, ou très difficilement, d’étudier des interactions protéiques transitoires ou de faible affinité. Par ailleurs, les conditions de lyse et de lavage à faible stringence, nécessaires à la purification des complexes protéiques, présentent des écueils majeurs parmi lesquels on retrouve l’impossibilité d’étudier ou de caractériser des protéines faiblement solubles comme les protéines membranaires, ainsi que l’existence de nombreux faux positifs associés aux complexes purifiés sans qu’ils en soient spécifiques (Figure 2). Enfin, cette technique nécessite d’utiliser des anticorps ayant une haute spécificité et une forte affinité pour la protéine d’intérêt, limitant fréquemment les possibilités d’étude de certaines protéines pour lesquelles ces anticorps n’existent pas ou n’ont pas ces qualités.

Table II. Approche AP-MS APEX BioID FRET PLA Y2H Mécanisme Purification par affinité de complexes protéiques (principalement par immunoprécipitation) Marquage proximal avec de la biotine activée Marquage proximal avec de la biotine activée Émission de fluorescence par tranfert d’énergie de résonance entre fluorophores Détection de fluorescence conjuguée à de l’ADN amplifié Expression d’un gène rapporteur par complémentarité de deux domaines fonctionnels Période d’identification À un instant donné Quelques minutes ~24 heures À un instant donné À un instant donné À un instant donné Avantages Identification d’interactions directes Marquage in vivo Marquage in vivo Identification d’interactions directes Facilité technique et rapidité de l’expérience Facilité de culture Possibilité d’étiqueter la protéine cible Identification d’interactions fortes, faibles et transitoires Identification d’interactions fortes, faibles et transitoires Identification de l’interaction in vivo Visualisation de la localisation de l’interaction Outils moléculaires à disposition nombreux Peut être quantitative Adapté à l’étude de protéines membranaires Adapté à l’étude de protéines membranaires Visualisation de la localisation de l’interaction Possibilité d’étiqueter les protéines cibles Automatisation des cribles Inconvénients Faux-positifs limités Faux-positifs limités Identification d’interactions fortes seulement Nécessite de générer une protéine de fusion Nécessite de générer une protéine de fusion Nécessite de générer des protéines de fusion Utilisation de matériel fixé Contexte cellulaire non pertinent Non adapté à l’étude de protéines membranaires Taille de l’enzyme APEX (~28 kDa) Taille de l’enzyme BirA* (~32 kDa) Taille des fluorophores Nécessite des anticorps validés en immunochimie Modifications post-traductionnelles non-exhaustives Risque de faux-positifs Stress oxydatif par le substrat (peroxyde d’hydrogène) La biotinylation peut perturber le comportement cellulaire Calculs de quantification des signaux d’émission Expérience onéreuse Taux élevé de faux-positifs Applicable sur modèles cellulaires ou animaux Oui Oui Oui Oui Oui NA Applicable sur échantillons cliniques Oui Non Non Non Oui NA Lecture Spectrométrie de masse Western-blot Spectrométrie de masse Western-blot Spectrométrie de masse Western-blot Microscopie Microscopie Culture par sélection Particularités, avantages et inconvénients des techniques d’identification des IPP. AP-MS : affinity purification-mass spectrometry ; APEX : engineered ascorbate peroxidase ; BioID : proximity-dependent biotinylation identification ; FRET : Förster resonance energy transfer ; NA : non applicable ; PLA : proximity ligation assay ; Y2H : yeast-two-hybrid.

Pour des cellules en culture, la protéine d’intérêt peut également être étiquetée avec un peptide (GFP [green fluorescent protein], FLAG-TAG², etc.), ce qui permet d’utiliser des anticorps de hautes spécificité et affinité vis-à-vis de ces étiquettes et d’améliorer les étapes de purification. C’est le principe utilisé par la méthode TAP (tandem affinity purification) qui utilise un double étiquetage de la protéine et une double purification d’affinité afin d’augmenter la spécificité et limiter le taux de faux positifs [7]. D’autres approches, comme le « pull-down » qui repose sur des protéines « appât » réactives, permettent de s’affranchir de l’utilisation d’anticorps spécifiques.

Développée à la fin des années 1980 [8], l’approche double-hybride utilise la levure Saccharomyces cerevisiae pour explorer des IPP binaires. Ce système est fondé sur la complémentarité de différents domaines isolés de facteurs de transcription de la levure pour activer un gène rapporteur et ainsi produire un signal quantifiable : la protéine d’intérêt est fusionnée à un domaine de fixation à l’ADN et les protéines cibles à un domaine d’activation de la transcription. Si les deux protéines interagissent entre elles, le complexe devient fonctionnel et active la transcription d’un gène rapporteur (Figure 1). Les domaines de fixation à l’ADN et d’activation sont généralement issus du facteur de transcription GAL4. Plusieurs gènes rapporteurs peuvent être utilisés, comme des gènes contrôlant la croissance de la cellule ou le gène lacZ codant la β-galactosidase nécessaire au crible blanc/bleu révélateur de l’IPP³ [9]. Il peut s’agir d’approches séquentielles évaluant des interactions supposées, l’une après les autres, ou d’approches matricielles à haut débit. Ces dernières sont fondées sur le criblage de banques d’ADN complémentaires et permettent de tester plus de 6 000 interactions différentes en un nombre réduit d’expériences [10,11]. L’ensemble de ces méthodes a permis des analyses à l’échelle du protéome, en particulier humain, et a révélé, comme pour les purifications d’affinité, de larges réseaux d’interactions incluant plusieurs centaines, voire parfois plusieurs milliers de partenaires (Tableau I). D’autres études, à une échelle plus réduite, ont permis d’identifier des mécanismes biologiques de maladies neurodégénératives comme la maladie de Huntington [12], ou des interacteurs de protéines surexprimées dans plusieurs cancers [13]. Le système double-hybride a donc été très largement utilisé ces dernières années et a permis de déterminer un grand nombre d’interactions référencées dans les bases de données. Cependant, il présente un certain nombre d’inconvénients (Tableau II). S’il permet, en effet, d’identifier des IPP binaires permanentes, il révèle difficilement les interactions transitoires et, à l’inverse, un trop grand nombre d’interactions qui ne sont pas physiologiques (avec des taux de faux positifs estimés entre 25 et 45 %) [14] (Figure 2). De plus, plusieurs interactions ne sont pas identifiées par cette technique en raison de problèmes liés à l’apparition d’une toxicité, à l’altération de la structure des protéines fusionnées à GAL4, aux modifications post-traductionnelles propres aux levures qui sont parfois inadaptées aux protéines étudiées, ou encore à la localisation particulière d’un des partenaires (protéines membranaires). Plusieurs études pointent également la faible reproductibilité des résultats obtenus lors d’analyses indépendantes [9]. Des évolutions méthodologiques ont toutefois permis de lever certaines limites, comme la méthode yeast-3-hybrid qui détermine les interactions entre 3 protéines [15], ou la méthode MYTH (membrane yeast two-hybrid) qui utilise la complémentarité de l’ubiquitine pour étudier l’interaction entre deux protéines membranaires [16]. Pour une vision plus exhaustive des méthodes d’identification des interactions protéine-protéine chez la levure, le lecteur pourra se référer à la revue de Anna Brückner et al. [17].

Développée en 2012, le BioID utilise la capacité naturelle de l’enzyme BirA à biotinyler les protéines [20]. Cette enzyme bactérienne, isolée d’Escherichia coli, est un co-facteur de l’acétyl-CoA carboxylase. Elle a pour fonction de biotinyler une de ses sous-unités et de réguler l’opéron biotine. Dans l’approche BioID, et en présence d’ATP et de biotine, BirA va générer l’espèce réactive biotinoyl-5’-AMP (biotin-AMP), la retenir dans son site actif, et faciliter son transfert sur un résidu lysine d’une protéine cible. Afin de permettre un marquage plus large des protéines à proximité, un variant de BirA (BirA*, portant la mutation p.R118G) est utilisé. BirA* a une affinité plus faible pour la biotin-AMP que BirA, ce qui permet la libération du site actif et la biotinylation des protéines environnantes dans un rayon de 10 nm [21]. Ce marquage est en général effectué sur une durée de 24 heures, permettant de retranscrire la dynamique des interactions protéiques, notamment les interactions transitoires, dans des conditions physiologiques, et avec une bonne fiabilité (Figure 2). Un des autres avantages du BioID est de pouvoir utiliser des conditions stringentes de lyse et de lavage lors de la purification par affinité, permettant ainsi de solubiliser les protéines membranaires, de les identifier, d’augmenter la pureté des échantillons et limiter le taux de faux positifs, et de mettre en évidence les IPP faibles et transitoires, ce qui est habituellement impossible avec les techniques classiques (Tableau II). Cette approche a ainsi permis de caractériser à large échelle l’interactome de la voie de signalisation Hippo, qui oscille rapidement d’un état inactif à actif en réponse aux stimulus de l’environnement cellulaire [22], ou de cartographier le réseau d’interactions de plus de 58 protéines localisées à l’interface des centrosomes et des cils dans les cellules humaines [23]. En cancérologie, et plus particulièrement dans le cas des carcinomes pulmonaires épidermoïdes, le BioID a, pour la première fois, permis de révéler l’implication d’EP300 (E1A-binding protein p300), une histone acétyl-transférase, comme interacteur spécifique du facteur de transcription SOX2 (SRY[sex-determining region Y]-box 2) et son rôle clef dans la différenciation et la croissance tumorale [24] (Tableau I). En 2015, le BioID a aussi permis, en utilisant des xénogreffes de cellules humaines, d’identifier de nouveaux interacteurs de c-Myc, un proto-oncogène découvert il y a presque 40 ans et dont la compréhension reste toujours incomplète [25,26]. Dans le domaine des maladies infectieuses, le BioID a été utilisé avec succès dans l’étude de la transmission à l’homme du parasite Plasmodium berghei au travers de l’identification de MTRAP (merozoite-specific thrombospondin-related anonymous protein), une protéine libérée par le parasite lors du processus d’invasion et qui interagit avec l’aldolase de l’hôte [27]. Enfin, le BioID a été transposé avec succès en biologie végétale, notamment par l’étude du facteur de transcription OsFD2 (impliqué dans le développement des feuilles) dans les protoplastes de riz [28]. Il fait ainsi désormais partie des outils d’étude des interactions protéine-protéine pour les botanistes [29, 30].

Bien que cette approche présente de nets avantages par rapport aux approches classiques, on peut néanmoins noter qu’elle est associée à quelques inconvénients. Ainsi, elle nécessite la présence et l’accès de lysines à la surface des protéines d’intérêt pour en permettre la biotinylation par BirA*. Par ailleurs, BirA* est une protéine de taille relativement importante par rapport aux étiquettes plus classiques comme l’hémagglutinine (HA) ou FLAG-TAG (32 kDa versus 1 kDa). Cette contrainte peut altérer la structure de la protéine cible et/ou en modifier le comportement ou l’activité. Les biotinylations des lysines sur la protéine cible peuvent également altérer son comportement vis-à-vis de ses interacteurs (Tableau II). Précisons que le temps nécessaire à la biotinylation des protéines est relativement long (environ 24 heures), ce qui n’est pas adapté à l’identification d’interactions protéiques à cinétique rapide. Ainsi, des biotine ligases de tailles plus réduites et à activités enzymatiques plus élevées continuent d’être recherchées ou développées afin d’améliorer la caractérisation des réseaux d’interactions protéiques. Grâce à un temps de marquage réduit (environ 10 min), le TurboID présente ainsi un avantage significatif comparé au BioID pour donner une résolution précise des interactomes [31].

Un écueil généralement attribué aux techniques de marquages de proximité est le risque d’identifier des protéines proches de la protéine d’intérêt, mais qui sont en fait en dehors de son réseau d’interaction. Les approches combinées de BioID et de purification d’affinité permettent alors de remédier à cet écueil, identifiant, en une seule expérience, les interactions directes et proximales de la protéine d’intérêt [32].

Au final, le BioID offre une nouvelle approche pour l’analyse des réseaux d’interactions et permet de mettre en évidence des interactions de proximité décrivant l’environnement local dans lequel ces interactions se réalisent.

Une variante conditionnelle du BioID a été proposée très récemment [33]. Dans cette approche, deux domaines fonctionnels de BirA* sont fusionnés à deux interacteurs d’intérêt. Lorsque ces deux protéines se rencontrent, les deux domaines de BirA* interagissent également, rendant l’enzyme fonctionnelle. Ce n’est donc que lorsque le complexe protéique est formé que la biotine-AMP sera générée et pourra biotinyler les interacteurs du complexe étudié (Figure 1) [33]. Cette approche permet donc de réduire significativement le spectre des IPP pour ne s’intéresser qu’aux interacteurs spécifiques du complexe protéique étudié [33, 34].

La méthode APEX, développée en 2013, repose sur le même principe que le BioID [35]. Elle utilise une enzyme différente, l’ascorbate peroxydase monomérique, pour biotinyler les protéines présentes à proximité d’une protéine d’intérêt (Figure 1). En présence de peroxyde d’hydrogène, cette enzyme oxyde le biotine-phénol en biotine-phénoxyl, un radical à demi-vie courte (moins de 2,5 ms) qui va se lier de façon covalente avec les acides aminés riches en électrons, tels que les tyrosines, les tryptophanes, les histidines et les cystéines, et ceci dans un rayon d’environ 20 nm autour de la protéine cible. La principale différence avec le BioID réside dans la durée d’incubation nécessaire pour biotinyler les protéines, beaucoup plus courte avec le peroxyde d’hydrogène (entre une minute à quelques heures) du fait de la toxicité du composé sur les cellules. Comme pour BirA, un variant de l’APEX (APEX2, p.A134P) a été développé pour augmenter l’efficacité catalytique de l’enzyme et permettre des études sur des niveaux d’expression plus faibles de la protéine d’intérêt [36]. Si l’APEX propose une description rétrospective des interactions protéiques un peu moins large que ne le fait le BioID, cette technique est néanmoins particulièrement adaptée à l’identification spécifique des interactions protéiques transitoires dans une fenêtre de temps courte (Figure 2 et Tableau II). C’est le cas, par exemple, des réseaux d’interactions de protéines de signalisation cellulaire dont l’activation est très rapide. L’approche APEX a été utilisée dans quelques applications cliniques, dont une étude sur les granules de stress, des agrégats de ribonucléoprotéines impliquées notamment dans des maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer [37], ou une étude sur le protéome des gouttelettes lipidiques retrouvées dans des maladies du métabolisme comme le diabète [38]. Dans les deux cas, des réseaux protéiques denses jusqu’alors inconnus ont pu être mis en évidence, ouvrant de nouvelles voies dans la compréhension de ces maladies et l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques.

L’APEX, comme le BioID, sont des techniques transposables chez des organismes multicellulaires comme la souris et la drosophile, ce qui marque un pas de plus dans la caractérisation des interactions protéiques dans un contexte in vivo pertinent [25, 39]. Au-delà de l’étude des réseaux d’interactions, l’approche APEX permet également de réaliser des cartographies protéiques d’organelles ou de compartiments subcellulaires, comme la matrice mitochondriale ou l’espace inter-membranaire mitochondrial (Tableau I) [35, 40]. Mais comme le BioID, l’APEX présente un certain nombre d’inconvénients. Elle nécessite notamment, comme pour BirA, une accessibilité des acides aminés pour un marquage efficace des complexes protéiques. L’exposition au peroxyde d’hydrogène peut également modifier la physiologie de la cellule en activant des voies de signalisation en réponse au stress oxydatif, ou la dynamique des organelles, ou les interactions protéiques dans leur ensemble (Tableau II).

Après leur isolement, l’identification des interacteurs pourra être réalisée par spectrométrie de masse. Si cette méthode fournit une vision plus exhaustive que les techniques plus traditionnelles comme le western blot, elle induit, en elle-même, plus de complexité dans les analyses. Plusieurs méthodes d’analyses statistiques des données recueillies sont en effet proposées ; elles impactent directement le nombre d’interacteurs qui seront identifiés [41, 42]. Il est donc finalement nécessaire de s’interroger sur la méthode de sélection des intéracteurs, selon la question biologique que l’on se pose.

Le PLA, parfois appelé in situ PLA (isPLA), est une méthode de détection des interactions entre deux protéines par fluorescence [43]. Les deux protéines cibles sont détectées par des anticorps spécifiques, qui seront révélés par des anticorps secondaires (des anticorps anti-anticorps) conjugués à des oligonucléotides. Si les deux protéines sont dans un environnement proche (moins de 40 nm), les oligonucléotides respectifs pourront s’hybrider et former un brin d’ADN circulaire qui, après ligation, sera amplifié par PCR (polymerase chain reaction) en cercle roulant, générant un ADN simple brin composé de copies répétées. La présence de nucléotides préalablement marqués par des fluorophores permettra la détection de l’ADN amplifié par microscopie de fluorescence (Figure 1) [44]. Cette technique est adaptée à la détection de tous types d’interactions protéiques impliquant notamment des protéines membranaires, nucléaires ou cytosoliques [45, 46]. Elle peut être adaptée à différents types d’échantillons, qu’il s’agisse de cellules fixées ou de coupes de tissus fixés ou congelés (Tableau II). Cette approche a ainsi permis de quantifier l’interaction entre l’EGFR, le récepteur de l’EGF (epidermal growth factor), et la protéine adaptatrice GRB2 (growth factor receptor-bound protein 2), et d’utiliser cette mesure comme marqueur prédictif de la survie globale de patients présentant un adénocarcinome pulmonaire et traités par les inhibiteurs de tyrosine kinase de l’EGFR de première génération, indépendamment du statut mutationnel du gène EGFR [47].

Comme le PLA, la technique FRET permet de détecter in vivo les interactions directes entre deux protéines par émission de fluorescence. Cette approche nécessite cependant une ingénierie moléculaire afin de faire exprimer par les cellules étudiées, les protéines d’intérêts fusionnées à un fluorophore donneur (pour l’une) et un fluorophore accepteur (pour l’autre). Lorsque les deux protéines fusionnées, qui sont exprimées dans les cellules, ont interagi, le fluorophore donneur est alors excité par un stimulus lumineux ; il transfère son énergie par résonnance au fluorophore accepteur, lequel émet à son tour un signal fluorescent à une longueur d’onde spécifique [48] (Figure 1). L’avantage de cette technique est de permettre une analyse dynamique des interactions in vivo sur des cellules en culture. La spécificité du transfert d’énergie entre donneur et accepteur réduit également significativement le taux de faux positifs (Figure 2). Néanmoins, une des limitations de cette approche est qu’elle n’est pas applicable à des échantillons cliniques que l’on ne peut transfecter afin d’exprimer les protéines fusionnées, comme des coupes de tissus (Tableau II).

Le BRET exploite le même principe de transfert d’énergie de résonance que le FRET à la différence qu’il ne nécessite pas de source extérieure de lumière [49]. Le signal lumineux d’excitation est, dans ce cas, produit par une enzyme, la luciférase par exemple, qui émet de la lumière lorsqu’elle est en contact avec son substrat. Ceci permet un transfert d’énergie dans un rayon réduit d’environ 10 nm. Le BRET remédie à certains écueils du FRET, comme l’auto-fluorescence, la perte de fluorescence par photoblanchiment (photobleaching) et la diffusion dynamique de la lumière (light scatterring) [50].