Vignette (Photo © Inserm- Thérèse Couderc).

Parasites intracellulaires obligatoires, les virus dépendent exclusivement de la machinerie cellulaire pour accomplir leur cycle de réplication et produire de nouvelles particules infectieuses. En réponse à cette invasion, la cellule met en place différentes stratégies de défense afin d’éliminer ce pathogène. De leur côté, les virus évoluent et s’adaptent aux différentes stratégies de défense de la cellule qu’ils infectent, ce qui conduit à une « course à l’armement » constante entre virus et cellule.

Une des voies cellulaires impliquée dans cette dynamique d’interaction entre les virus et leur hôte est la voie reposant sur les microARN (miARN). Ces petits ARN sont des ARN non-codants qui participent à la régulation, au niveau post-transcriptionnel, de l’expression de gènes jouant un rôle dans de nombreux processus cellulaires. Ils sont transcrits sous la forme d’un long précurseur dont la maturation s’effectue en deux étapes : dans le noyau, par le microprocesseur (Drosha et DGCR8 [DiGeorge critical syndrome region 8]), et, après export dans le cytoplasme, par Dicer et son cofacteur TRBP (tat RNA-binding protein). Le miARN mature est alors chargé sur une protéine Argonaute et dirigé vers son ARN messager (ARNm) cible grâce à la séquence « seed » correspondant aux nucléotides 2 à 8 qu’il contient. Cette séquence lui permet de guider la protéine Argonaute sur ses ARNm cibles par appariement de séquence, le plus souvent dans la région 3’ non traduite (UTR) de ces ARNm. La fixation de la protéine Argonaute sur un ARNm induit l’inhibition de l’initiation de sa traduction et sa dégradation par le recrutement de protéines à l’origine de sa déadénylation (Figure 1) [1].

Figure 1. Biogenèse et fonction canoniques des miARN. Les gènes de miARN sont transcrits par l’ARN polymérase II en précurseur primaire de microARN (pri-miARN) qui est clivé dans le noyau par le complexe Microprocesseur (Drosha et son cofacteur DGCR8) pour produire un miARN précurseur à la structure en épingle à cheveux (pré-miARN) qui est exporté vers le cytoplasme par l’exportine V. Le pré-miARN est ensuite clivé par Dicer en duplex de miARN, qui sera ensuite chargé sur une protéine Argonaute (AGO) dans le complexe de silencing induit par l’ARN (RISC). Un des brins reste lié à AGO (miARN mature) et joue un rôle clef dans la régulation des gènes au niveau post-transcriptionnel en ciblant les ARNm par liaison de la région « seed » (nucléotides en position 2-8) (le site de liaison représenté par un rectangle rouge). La protéine adaptatrice GW182 est recrutée par RISC et peut interagir avec les protéines de liaison à la queue polyA (PABP) induisant le recrutement du complexe de déadénylation CCR4-NOT. L’ARNm est déstabilisé par la déadénylation et le decapping conduisant à sa dégradation. La traduction des ARNm ciblés est également réprimée par l’inhibition de l’assemblage du complexe de préinitiation.

Figure 1. Biogenèse et fonction canoniques des miARN. Les gènes de miARN sont transcrits par l’ARN polymérase II en précurseur primaire de microARN (pri-miARN) qui est clivé dans le noyau par le complexe Microprocesseur (Drosha et son cofacteur DGCR8) pour produire un miARN précurseur à la structure en épingle à cheveux (pré-miARN) qui est exporté vers le cytoplasme par l’exportine V. Le pré-miARN est ensuite clivé par Dicer en duplex de miARN, qui sera ensuite chargé sur une protéine Argonaute (AGO) dans le complexe de silencing induit par l’ARN (RISC). Un des brins reste lié à AGO (miARN mature) et joue un rôle clef dans la régulation des gènes au niveau post-transcriptionnel en ciblant les ARNm par liaison de la région « seed » (nucléotides en position 2-8) (le site de liaison représenté par un rectangle rouge). La protéine adaptatrice GW182 est recrutée par RISC et peut interagir avec les protéines de liaison à la queue polyA (PABP) induisant le recrutement du complexe de déadénylation CCR4-NOT. L’ARNm est déstabilisé par la déadénylation et le decapping conduisant à sa dégradation. La traduction des ARNm ciblés est également réprimée par l’inhibition de l’assemblage du complexe de préinitiation.

Dans cet article, nous passerons en revue les techniques couramment utilisées pour identifier les miARN impliqués dans les infections virales ainsi que leurs cibles. Nous décrirons ensuite quelques exemples de virus dont l’infection est modulée par des miARN et discuterons des possibles applications thérapeutiques résultant du ciblage de ces ARN régulateurs.

Le potentiel de régulation des miARN est très important : il existe en effet environ 2 000 gènes codant des miARN qui ont été annotés dans le génome humain. En raison du faible nombre de nucléotides requis pour leur interaction avec leur cible, chacun de ces miARN peut potentiellement participer à la régulation de nombreux ARNm, y compris ceux qui ont une origine virale. L’expression et l’abondance de ces molécules régulatrices diffèrent selon le type cellulaire étudié, ce qui a un impact sur le réseau de cibles potentielles. Une des premières approches à mettre en œuvre lorsqu’on veut identifier les miARN participant à la régulation de l’infection par un virus donné sera donc de déterminer le profil d’expression de ces miARN dans les cellules qu’il cible en l’absence d’infection et après l’entrée du virus en utilisant principalement le séquençage à haut débit [2]. D’autres approches, comme les puces à ARN, ont également été employées avec succès [3]. La comparaison des profils ainsi obtenus mettra en évidence des différences d’expression de certains miARN selon les conditions, indiquant leur possible implication dans l’infection. En parallèle, l’analyse globale de l’expression des ARNm pourra aider à identifier les différentes voies de régulation affectées par le virus.

Une autre approche consiste à évaluer par des études phénotypiques l’effet de la surexpression d’un miARN ou de son inhibition directement sur le virus. Les virus utilisés pour ce type d’approche sont souvent des virus modifiés génétiquement afin qu’ils expriment une protéine rapportrice, comme la GFP (green fluorescent protein). Cette approche a l’avantage de ne pas engendrer de biais, si on a la possibilité d’utiliser un criblage à haut débit ciblant tous les miARN connus [4]. Elle a cependant des limites, notamment pour identifier les miARN qui sont inhibés lors de l’infection. Un type cellulaire n’exprime qu’une centaine de miARN fonctionnels différents. Il est donc possible de ne pas pouvoir révéler l’intérêt du blocage d’un miARN particulier en raison de l’absence de son expression naturelle dans la cellule étudiée.

Le miARN candidat ayant été mis en évidence, l’étape suivante consiste à identifier ses cibles afin de comprendre son rôle dans la régulation de l’infection virale. Un grand nombre d’outils bioinformatiques permettent désormais de prédire les cibles des miARN identifiés. Ces outils, tels que TargetScan [5, 6], miRanda [7], PicTar [8], ou DIANA-microT [9] (cette liste n’est pas exhaustive) se fondent sur la complémentarité de séquences entre les 3’UTR des ARNm cellulaires et la séquence « seed » du miARN. Ils restent cependant limités aux cibles cellulaires. Afin de pouvoir prédire les cibles virales des miARN, PW Hsu et al. ont développé le logiciel ViTa qui permet l’analyse des cibles potentielles au sein des différentes séquences d’ARN viral [10]. Néanmoins, l’utilisation de ces logiciels de prédiction se heurte aux limites inhérentes à l’approche utilisée, ce qui conduit inévitablement à la prédiction de nombreux faux-positifs, des cibles potentielles mais qui ne sont en fait pas impliquées dans la régulation par les miARN [11]. Ils ne tiennent également pas toujours compte des interactions possibles qui ne sont pas canoniques.

D’autres possibilités, plus directes, existent afin d’identifier les cibles des miARN identifiés. Les complexes entre miARN et ARNm cibles peuvent en effet être isolés par des méthodes d’immunoprécipitation (associées à des pontages entre protéines et ARN par action des ultra-violets, par exemple) ciblant spécifiquement les protéines Argonautes liées aux miARN [12–14]. Ainsi isolés, les ARNm cibles présents dans les complexes isolés pourront être identifiés par séquençage à haut débit. Cette technique révèle l’ensemble des ARNm cibles d’un ou plusieurs miARN et permet d’entrevoir les voies de régulation impliquées au niveau génomique.

Quelle que soit l’approche utilisée, les cibles identifiées nécessitent d’être validées expérimentalement. Cela peut être réalisé dans un premier temps, à l’aide de systèmes rapporteurs reposant le plus souvent sur la luciférase, afin d’évaluer les changements d’expression de l’ARNm et/ou de la protéine liés au gène cible prédit, induits par la surexpression ou l’inhibition du miARN étudié.

Il existe un grand nombre d’exemples de régulation de l’infection virale reposant sur les miARN. Ils peuvent agir de façon directe ou indirecte et avoir un effet positif ou négatif sur l’accumulation du virus (Figure 2). Le Tableau I présente quelques exemples choisis dans la littérature qui rendent compte de tous les mécanismes de régulation possibles affectant une panoplie de virus taxonomiquement différents. Nous en décrivons ci-après quelques-uns plus en détails.

Figure 2. Exemples de mécanismes d’action des miARN modulant l’infection virale. A. L’effet direct du miARN sur la régulation du virus se produit par le ciblage direct des ARN viraux, soit du génome, soit des transcrits, dans différentes régions telles que 3’UTR, 5’UTR ou des séquences codantes (CDS). La liaison entraîne une stabilisation de l’ARN, une traduction améliorée ou une réplication altérée. B..L’effet indirect implique la modulation de l’expression d’un transcrit cellulaire codant un facteur hôte nécessaire pour une ou plusieurs étapes du cycle viral. La modulation de l’expression des récepteurs impacte l’entrée du virus, régulant ainsi son tropisme. Les cofacteurs nécessaires aux complexes de réplication ou à la traduction peuvent réduire ou améliorer la réplication virale et la production de protéines virales, respectivement. Les miARN participent également à l’amélioration ou à la répression des réponses cellulaires à l’infection, par exemple en inhibant ou stimulant la réponse immunitaire ou en stimulant des mécanismes de défense tels que l’induction de l’apoptose. Les étapes du cycle viral sont représentées en bleu tandis que les facteurs de l’hôte et les voies associées sont marqués en orange.

Figure 2. Exemples de mécanismes d’action des miARN modulant l’infection virale. A. L’effet direct du miARN sur la régulation du virus se produit par le ciblage direct des ARN viraux, soit du génome, soit des transcrits, dans différentes régions telles que 3’UTR, 5’UTR ou des séquences codantes (CDS). La liaison entraîne une stabilisation de l’ARN, une traduction améliorée ou une réplication altérée. B..L’effet indirect implique la modulation de l’expression d’un transcrit cellulaire codant un facteur hôte nécessaire pour une ou plusieurs étapes du cycle viral. La modulation de l’expression des récepteurs impacte l’entrée du virus, régulant ainsi son tropisme. Les cofacteurs nécessaires aux complexes de réplication ou à la traduction peuvent réduire ou améliorer la réplication virale et la production de protéines virales, respectivement. Les miARN participent également à l’amélioration ou à la répression des réponses cellulaires à l’infection, par exemple en inhibant ou stimulant la réponse immunitaire ou en stimulant des mécanismes de défense tels que l’induction de l’apoptose. Les étapes du cycle viral sont représentées en bleu tandis que les facteurs de l’hôte et les voies associées sont marqués en orange.

Lorsqu’un miARN exerce un effet antiviral, qu’il soit direct ou indirect, le virus évolue afin de contourner cet effet inhibiteur. Cette évolution peut se traduire par l’apparition de mutations dans la séquence virale ciblée par le miARN mais elle peut aussi reposer sur des mécanismes moléculaires plus complexes. La réplication du virus de la vaccine n’est ainsi pas concernée par des régulations dépendant de miARN, dont il induit la dégradation globale et non spécifique. Sa protéine VP55 possède une activité polymérase qui ajoute une queue poly A aux miARN, ce qui déclenche leur dégradation par des ribonucléases [24]. Certains miARN sont également inhibés spécifiquement par des virus. C’est le cas de miR-27 dont la stabilité est fortement réduite par le cytomégalovirus murin (MCMV). Surexprimé expérimentalement dans les cellules, miR-27 présente un effet antiviral qui n’est pas observé dans les cellules qui ne sont pas transformées [25]. L’échappement à l’effet antiviral de miR-27 du MCMV repose sur l’expression d’un transcrit viral qu’il cible, qui induit la dégradation du miARN mature [26, 27]. Ce phénomène peut apparaître dans des conditions particulières dans lesquelles l’ARN cible du miARN est fortement exprimé et présente un degré de complémentarité élevé avec le miARN [28].

L’utilisation de miARN comme molécules thérapeutiques n’a pas conduit jusqu’à présent à l’élaboration d’un médicament. Les miARN restent néanmoins très prometteurs pour le traitement de plusieurs pathologies [29], y compris pour les maladies infectieuses. Leur utilisation comme traitement antiviral montre qu’ils présentent une très faible immunogénicité. Du fait de leur conservation au cours de l’évolution, ils peuvent être testés dans différents modèles animaux pour des essais précliniques. Des premiers essais ont ainsi été conduits afin de moduler l’infection par le virus de la grippe H1N1, qui peut être inhibé par plusieurs miARN spécifiques des cellules épithéliales respiratoires. L’administration intranasale de ces miARN a permis de contrôler l’infection et d’inhiber la réplication du virus chez la souris [30].

Bloquer un miARN jouant un rôle proviral est également envisageable. Plusieurs études portant sur l’utilisation d’inhibiteurs du miR-122 comme traitement antiviral ont en effet été menées, d’abord avec le développement du Miravirsen (Santaris Pharma), qui bloque son activité [31, 32], et avec son optimisation, sous la forme du RG-101 (une forme conjuguée à une N-acétylgalactosamine favorisant sa pénétration dans les cellules hépatiques), qui ont permis de contrôler l’infection et de réduire la charge virale de patients infectés par le HCV [33].

Un point sur lequel des progrès restent néanmoins à faire concerne l’administration de ces molécules dans l’organisme. Celle-ci peut en effet poser problème selon le tissu qui est ciblé, particulièrement dans le cas des virus neurotropiques pour lesquels la barrière hématoencéphalique constitue un obstacle à la bonne pénétrance du médicament.

Fondées sur le mode d’action des miARN, différentes applications peuvent également être envisagées non seulement pour le traitement des maladies virales, mais aussi pour leur prévention. Il est ainsi possible de détourner la fonction de miARN cellulaires afin de minimiser les risques possibles lors de l’utilisation de vaccins utilisant des virus atténués : l’insertion dans le génome du virus vaccinal d’un site de liaison pour un miARN exprimé de manière tissu-spécifique peut ainsi restreindre sa réplication et empêcher sa propagation dans certains types cellulaires. Cette approche a été testée avec le virus de la grippe dans le génome duquel l’insertion d’un site complémentaire au miARN ubiquitaire miR-21 a conduit à l’atténuation du virus dans plusieurs types cellulaires [34].

Enfin, l’ajout dans le génome viral de séquences cibles d’un miARN particulier peut également permettre de limiter la toxicité des virus oncolytiques [35]. Chez la souris, un inconvénient du traitement par le picornavirus oncolytique coxsackie A21 est le développement de myosites (ou myopathies inflammatoires, qui constituent un groupe de maladies rares auto-immunes du muscle). Ces effets secondaires touchant les myocytes peuvent être contrôlés en incluant des séquences cibles pour les miARN comme miR-206 et miR-133a, spécifiques des cellules musculaires [36].

Nous avons évoqué dans cette synthèse les différents moyens d’identification des miARN impliqués dans les infections virales, et les différents rôles qu’ils pouvaient jouer dans cette régulation. Les données de la littérature indiquent qu’il existe un certain nombre d’exemples de miARN cellulaires ayant des activités antivirales. Pourtant, le pouvoir inhibiteur des miARN dans le contexte d’infections virales reste un sujet controversé. Une étude menée par Bogerd et al. n’a en effet révélé aucune différence de production virale entre des cellules ne produisant pas de miARN (par délétion de Dicer) et la lignée parentale infectée avec différents virus [37].

D’autres virus utilisent les miARN pour leur réplication. Ils représentent donc une cible thérapeutique de choix puisqu’on peut envisager de développer de nouvelles thérapies qui les ciblent afin d’inhiber l’infection. Une étude récente indique que ce mode de régulation positive pourrait être plus utilisé qu’anticipé. Par des techniques d’immunoprécipitation de protéines Argonaute dans des lignées cellulaires infectées par différents virus, un autre mécanisme de régulation positive directe d’un virus par un miARN a en effet été révélé [38].

Un autre mode de détournement de la voie des miARN à l’avantage des virus, que nous n’avons pas abordé ici, a été montré. Il consiste en l’utilisation de la machinerie cellulaire par certains virus pour la synthèse de leurs propres miARN [39].

Il est encore trop tôt pour affirmer que les études sur l’importance des miARN dans le contexte d’infections virales permettront la mise au point de nouvelles approches thérapeutiques antivirales. Il est cependant clair que ces petits ARN régulateurs ne doivent pas être négligés. Peut-être faudra-t-il envisager de coupler l’inhibition d’un miARN proviral à une autre molécule, dans le but de proposer des outils plus puissants pour combattre les infections virales ?

Les auteurs déclarent n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article.

Notre laboratoire est financé par le Conseil européen de la recherche (ERC-CoG-647455 RegulRNA) et fait partie du réseau LABEX : ANR-10-LABX-0036_NETRNA, qui bénéficie d’un financement de l’État géré par l’Agence nationale de la recherche, dans le cadre des investissements d’avenir. EG est financée par le Programme Marie Curie de l’Union européenne par le biais du programme PRESTIGE coordonné par Campus France (PCOFUND-GA-2013-609102).