Au cours des 20 dernières années, le séquençage d’ADN s’est fortement démocratisé et son coût a considérablement diminué, passant de 100 millions de dollars par génome en 2001 à moins de 1 000 dollars aujourd’hui. Cette technologie, très largement répandue dans les laboratoires médicaux et de recherche, s’est même introduite dans les foyers en permettant aux particuliers d’obtenir la séquence de leurs propres génomes. Bien que les coûts actuels soient encore élevés, la synthèse d’ADN est appelée à connaître un essor similaire et devenir dans un futur proche un outil incontournable dans le domaine des biotechnologies. Les récentes innovations technologiques permettent de générer des molécules d’ADN toujours plus grandes et plus nombreuses. En 1979, le premier gène synthétique était constitué de 207 paires de bases (pb) [1]. Depuis, des fragments d’ADN de plus d’un million de pb (Mpb) ont été synthétisés et assemblés atteignant, pour certains, la taille de chromosomes complets [2,3] (Figure 1). Ces avancées marquent les débuts de l’ère de la « génomique synthétique », une discipline émergente de la biologie se situant à l’interface entre science et ingénierie et dont l’un des objectifs est de créer des organismes dont les génomes auront été complètement prédéterminés.

Figure 1. Évolution de la capacité de synthèse de génomes entiers en fonction du temps. Les techniques de synthèse et d’assemblage permettent de produire des constructions d’ADN de plus en plus grandes, qui peuvent maintenant atteindre plusieurs millions de nucléotides.

Figure 1. Évolution de la capacité de synthèse de génomes entiers en fonction du temps. Les techniques de synthèse et d’assemblage permettent de produire des constructions d’ADN de plus en plus grandes, qui peuvent maintenant atteindre plusieurs millions de nucléotides.

Après avoir résumé les techniques permettant de synthétiser et d’assembler de grandes molécules d’ADN, nous présenterons dans cette revue les résultats marquants de cette nouvelle discipline, la réglementation actuelle, qui incite à la vigilance, les aspects éthiques de cette recherche, ainsi que les développements attendus pour les prochaines années.

Bien que de nouvelles technologies de synthèse de molécules fondées sur l’utilisation d’enzymes soient en cours de développement et suscitent beaucoup d’intérêt [4], il n’existe pas encore de méthode permettant de créer chimiquement de longues molécules d’ADN sans accumuler un nombre important de mutations [5]. Les techniques actuelles reposent donc sur un assemblage progressif de courts fragments d’ADN simple-brin, les oligonucléotides, pour lesquels le taux d’erreur demeure relativement faible pour des tailles atteignant jusqu’à 200 nucléotides. La production de ces oligonucléotides par l’approche traditionnelle de la chimie des phosphoramidites¹ stagne depuis quelques années à un coût d’environ 0,05-0,15 dollar par nucléotide en fonction de la quantité produite. Cependant, l’introduction récente de puces à ADN permet d’augmenter considérablement le nombre de molécules produites et de diminuer significativement le prix des oligonucléotides à moins de 0,01 dollar par nucléotide. Ces puces servent de support physique sur lequel un grand nombre d’oligonucléotides de séquences différentes peuvent être synthétisés en parallèle, augmentant ainsi le rendement de la production. Ces courtes molécules d’ADN simple-brin peuvent ensuite être assemblées en utilisant des méthodes souvent apparentées à la réaction en chaîne par polymérase (polymerase chain reaction ou PCR) afin d’obtenir des fragments d’ADN pouvant atteindre quelques centaines à quelques milliers de pb (Figure 2). Plusieurs entreprises proposent de synthétiser ces fragments à un coût inférieur à 100 dollars par millier de pb (kpb), incitant ainsi les clients à commander des séquences d’ADN « prêtes à l’emploi » plutôt que de les amplifier par PCR puis, si nécessaire, de les assembler pour obtenir le produit désiré. Malgré des avantages certains en termes de gain de temps et d’argent, certaines contraintes demeurent. En effet, de nombreuses séquences restent encore difficiles à synthétiser à l’heure actuelle, notamment les séquences ayant un contenu en bases G et C très faible ou très élevé, ou encore des séquences présentant des structures secondaires, des répétitions ou des homopolymères.

Figure 2. Résumé des étapes de conception et de construction d’un génome synthétique. Des oligonucléotides synthétisés chimiquement sont habituellement assemblés in vitro en éléments pouvant atteindre quelques milliers de paires de bases (pb). Ceux-ci peuvent ensuite être combinés in vivo ou in vitro pour former des fragments pouvant aller jusqu’à environ 100 kpb. Finalement, un assemblage de ces fragments peut être complété in vivo pour obtenir des chromosomes complets de l’ordre du Mpb.

Figure 2. Résumé des étapes de conception et de construction d’un génome synthétique. Des oligonucléotides synthétisés chimiquement sont habituellement assemblés in vitro en éléments pouvant atteindre quelques milliers de paires de bases (pb). Ceux-ci peuvent ensuite être combinés in vivo ou in vitro pour former des fragments pouvant aller jusqu’à environ 100 kpb. Finalement, un assemblage de ces fragments peut être complété in vivo pour obtenir des chromosomes complets de l’ordre du Mpb.

Les fragments ainsi obtenus (comprenant entre 0,3 et 10 kpb) lors d’une synthèse initiale (Figure 2) peuvent à leur tour être combinés par assemblages itératifs en faisant appel à des techniques telles que l’assemblage de Gibson² [6], le Golden Gate³ [7] ou la recombinaison in vivo⁴ [8]. Des molécules d’ADN dont la taille finale varie de quelques centaines de pb jusqu’à plusieurs mégabases [9] peuvent ainsi être assemblées (Figure 2). Alors que des assemblages de taille inférieure ou égale à 10 kpb peuvent facilement être conservés en solution ou amplifiés de nouveau par PCR, si nécessaire, les assemblages de plus grandes tailles doivent être maintenus dans un vecteur. Ces vecteurs contiennent généralement une origine de réplication à copie unique, un système de partitionnement, et au moins un marqueur de sélection. Ces éléments permettent d’assurer la pérennité des fragments d’ADN clonés chez l’organisme hôte choisi. Par exemple, les BAC (bacterial artificial chromosome) sont utilisés chez les bactéries comme Escherichia coli, les YAC (yeast artificial chromosome) chez la levure Saccharomyces cerevisiae, les HAC (human artificial chromosome) dans des cellules humaines et les PAC (plant artificial chromosome) chez les plantes. Le développement de protocoles de transformation efficaces permettant d’introduire ces longues molécules d’ADN dans un organisme d’intérêt représente aussi un aspect essentiel pour l’utilisation de tels chromosomes. L’électroporation a d’abord été la méthode privilégiée, mais elle s’avère difficile pour des constructions dépassant 0,5 Mpb [10]. La transformation de sphéroplastes⁵ [11], la transplantation de génomes [12] et la transformation par fusion cellulaire [13] dans la levure ont par la suite été développées. Ces méthodes permettent la transformation des cellules avec des molécules d’ADN plus grandes, certaines pouvant même dépasser 1,5 Mpb.

Plus la taille d’une molécule d’ADN à assembler est grande, plus sa construction et son introduction dans un organisme à modifier deviennent complexes. Il n’est donc pas surprenant que les génomes viraux de petites tailles (5 à 30 kpb), aient été les premiers à être synthétisés.

Le premier génome entièrement synthétique fût celui du poliovirus, l’agent responsable de la poliomyélite, en 2002 [14]. Ce génome de 7 740 nucléotides a été synthétisé en trois fragments issus d’oligonucléotides synthétiques. Les fragments ont ensuite été clonés dans des plasmides qui ont enfin été combinés par digestion et ligation enzymatiques. La transcription de cet ADN synthétique en ARN viral a généré des poliovirus infectieux après transfection [14]. En 2003, l’équipe de John Craig Venter a développé une méthode d’assemblage de fragments d’ADN qui a permis de reconstruire le génome du bactériophage ΦX174 en moins de 15 jours [15]. Chacun des deux brins d’ADN du virus ont été synthétisés en courts oligonucléotides de 42 bases qui ont été assemblés dans une réaction inspirée de la PCR pour obtenir un seul chromosome linéaire de 5 386 pb. Ces deux expériences ont permis d’établir les bases des futurs assemblages de génomes. Depuis, plusieurs autres virus ont été synthétisés, comme le génome du bactériophage T7, celui du virus de la grippe espagnole de 1918 ou encore du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) (Tableau I). À l’heure actuelle, la synthèse de génomes viraux, que ce soit pour des virus à ADN ou à ARN, des virus pathogènes ou non-pathogènes, et quelles que soient leurs tailles (quelques milliers à plusieurs centaines de nucléotides), pose relativement peu de difficultés. Elle fournit un outil puissant pour étudier la fonction des gènes et mieux appréhender les mécanismes gouvernant la pathogénicité des virus. Il est aussi possible de recoder entièrement ces génomes viraux en jouant, par exemple, sur la dégénérescence des codons. Ces altérations permettent d’envisager des stratégies de lutte totalement inédites. Par exemple, des vaccins candidats, à base de virus atténués ou après modification de leurs spécificité d’hôtes, sont actuellement à l’étude [16–19].

Quelques années après la synthèse du génome du phage ΦX174, l’équipe de Venter a publié la synthèse complète d’un premier génome bactérien, celui de Mycoplasma genitalium [10]. Cette bactérie, qui possède le plus petit génome naturel permettant à une cellule de croître de manière autonome, appartient à la classe des Mollicutes, dont les membres sont caractérisés par leur petit génome et l’absence de paroi cellulaire. Le génome de M. genitalium a pu être assemblé de manière progressive en utilisant une approche hiérarchique : des petits fragments d’ADN d’environ 5 à 7 kpb ont d’abord été assemblés in vitro en fragments de plus en plus grands (jusqu’à environ 144 kpb), correspondant à des quarts de génomes, et propagés dans la bactérie E. coli. Les quarts de génomes ont ensuite été assemblés par recombinaison homologue chez la levure S. cerevisiae pour obtenir un chromosome complet de 580 kpb. Cette méthode a par la suite été améliorée pour reconstruire le génome de Mycoplasma mycoides sous-espèce capri, en utilisant uniquement la levure S. cerevisiae [20]. Ce génome a pu être transplanté dans la bactérie Mycoplasma capricolum sous-espèce capricolum, pour produire la première bactérie contrôlée par un génome synthétique. La poursuite de ces travaux a permis, en 2016, la création d’une bactérie au génome minimal (JCVI-syn3.0) duquel la majorité des gènes non-essentiels ont été retirés [3]. De nombreux projets visant à apporter des modifications extensives au génome naturel d’autres bactéries d’intérêt sont en cours, comme en témoigne le récent développement de deux souches d’E. coli n’utilisant respectivement que 59 et 57 codons des 64 habituellement retrouvés chez tous les autres organismes [21, 22]. Le projet Minibacillus, à l’image de JCVI-syn3.0, a, lui, pour objectif d’obtenir une souche minimale de la bactérie modèle Bacillus subtilis [23, 24] pour la caractériser entièrement et déterminer le rôle précis de chaque gène essentiel. Des projets de réductions des génomes de Streptomyces avermitilis [25, 26] et Pseudomonas putida [27] sont également en cours.

À la limite entre l’eucaryote et le procaryote, un chromosome mitochondrial de souris a déjà été synthétisé entièrement à partir d’oligonucléotides en seulement 5 jours [28]. En revanche, un tel génome n’a pas encore été introduit dans une mitochondrie vivante puisque les techniques de transformation de cette organelle restent difficiles à mettre en œuvre [29].

La suite logique consiste à générer les chromosomes d’un organisme eucaryote, ce qui a été initié il y a quelques années dans le cadre du projet Saccharomyces cerevisiae 2.0 (Sc2.0). Plusieurs laboratoires à travers le monde ont uni leurs efforts dans le but de synthétiser les 16 chromosomes de cette levure [30]. Le projet Sc2.0 ne vise pas seulement à recopier la séquence du génome. Certaines modifications, comme la délétion de plusieurs introns non-essentiels et le remplacement de tous les codons d’arrêt de la traduction (codons STOP) UAG par un équivalent UAA, ont aussi été apportées. L’insertion d’un site de recombinaison loxP à la suite de chaque gène non-essentiel permet également l’utilisation de la méthode SCRaMbLE (synthetic chromosome recombination and modification by loxP-mediated evolution) [31] visant à mélanger aléatoirement l’ordre des gènes afin d’obtenir puis d’étudier de nouvelles organisations génomiques supportant la vie. À la différence des projets précédents, les chromosomes de la levure Sc2.0 ne sont pas réassemblés pour ensuite être introduits intégralement dans la cellule. Des fragments de chromosomes natifs sont en effet remplacés progressivement par leurs équivalents modifiés, d’une taille de 30 à 60 kpb. La modification du génome est donc plus lente puisque la reconstruction d’un seul chromosome peut prendre plus d’une trentaine de cycles de remplacement nécessitant chacun des étapes de vérification portant autant sur la viabilité de la souche que sur la validité de la séquence introduite [2]. La reconstruction du génome Sc2.0 a débuté il y a environ 10 ans par la synthèse d’un des bras des chromosomes VI et IX de la levure [32] et s’est poursuivie avec la publication de la synthèse complète du chromosome III trois ans plus tard [33]. Par la suite, le consortium a annoncé la synthèse des chromosomes II [34], V [35], VI [36], X [37] et XII [2] dans un numéro spécial de Science. La reconstruction du génome de la levure se poursuit et culminera avec le rassemblement des différents chromosomes ainsi synthétisés dans une seule et même souche, ce qui devrait permettre d’obtenir le premier organisme eucaryote portant un génome synthétique.

Les chromosomes artificiels sont également des outils convoités par des chercheurs étudiant les plantes. Sans pouvoir actuellement synthétiser des chromosomes complets de novo, des chromosomes natifs peuvent être tronqués en mini-chromosomes qui peuvent être modifiés. Cet outil a déjà été utilisé chez plusieurs organismes tels que le maïs [38], Arabidopsis thaliana (arabette des dames) [39,40], le riz [41] et l’orge [42]. Des avancées importantes ont également été rapportées dans la construction et la manipulation de chromosomes de chloroplastes⁶, beaucoup plus faciles à assembler et à modifier que les chromosomes nucléaires [43]. Il est également possible de les transformer en utilisant des méthodes comme la biolistique⁷ [44].

Le consortium international Genome Project-Write (GP-write), formé en 2016 dans le but de promouvoir le développement des technologies permettant la synthèse et l’initialisation des génomes, propose de synthétiser un génome humain modifié et de l’introduire dans une lignée cellulaire [45] (→).

(→) Voir la Chronique génomique de B. Jordan, m/s n° 10, octobre 2016, page 898

Plusieurs laboratoires, par exemple aux États-Unis, en Chine, en Angleterre, au Canada et au Japon, ont signifié leur intérêt à y participer [46]. Plusieurs aspects, tant technologiques qu’éthiques, devront cependant être davantage développés avant d’entreprendre cette tâche colossale. Actuellement, une douzaine de projets pilotes sont en cours, dont un portant sur l’ingénierie de lignées cellulaires afin de les rendre plus sûres et d’améliorer leurs propriétés pour des applications biotechnologiques [47] (→).

(→) Voir la Chronique génomique de B. Jordan, m/s n° 8-9, aoûit-septembre 2018, page 749

Il n’est cependant pas question de modifier des organes ou des cellules germinales dans le cadre de ce projet.

La capacité à synthétiser des chromosomes et des génomes provoque certains débats. La synthèse du virus de la grippe espagnole de 1918 [48] et la récente création d’une version chimérique du virus de la variole équine [49] ont soulevé plusieurs questions sur le développement accidentel ou délibéré d’organismes potentiellement dangereux [52] (→).

(→) Voir le Forum de J.N. Tourier, m/s n° 2, février 2019, page 181

Bien que l’utilisation d’organismes pathogènes et de toxines soit bien réglementée, il y a encore peu de règles législatives déterminant les séquences de nucléotides qui peuvent être synthétisées. Face aux inquiétudes, le Department of health and human services (HHS) américain a publié en 2009 un document intitulé Screening framework guidance for providers of synthetic double-stranded DNA. Ce document décrit une procédure volontaire à appliquer par les compagnies offrant des services de synthèse d’ADN pour contrôler l’utilisation de séquences à des fins malveillantes. Les grandes lignes de cette approche consistent à établir l’identité des acheteurs et à déterminer si les séquences qu’ils commandent peuvent représenter une menace. Cette stratégie d’autogouvernance par les compagnies a été adoptée pour permettre aux chercheurs ayant les équipements et la connaissance requise pour manipuler des organismes potentiellement dangereux, d’effectuer leur recherche sans contraintes majeures. Plusieurs compagnies se sont concertées pour fonder le consortium International gene synthesis consortium (IGSC) dont les membres doivent suivre les recommandations du HHS. Ces entreprises représentent 80 % des fournisseurs de séquences dans le monde, assurant ainsi un certain niveau de contrôle du risque biologique. Les risques associés à la biologie de synthèse ont également été évalués en décembre 2010 par la Presidential commission for the study of bioethical issues (PCSBI). Dans un rapport publié sous le titre New directions : the ethics of synthetic biology and emerging technologies, il est conclu que les capacités actuelles de la biologie de synthèse ne représentent pas un danger en fonction des connaissances scientifiques. Il recommande toutefois une réévaluation de ces capacités au fil des années pour légiférer si un risque plus concret se manifeste. La génomique synthétique possède donc un potentiel important pour mieux comprendre la vie ou pour de nouvelles applications biotechnologiques. Il reste néanmoins essentiel de demeurer vigilant pour éviter les usages éventuellement dangereux ou malicieux.

La synthèse de chromosomes pose également des questions d’ordre éthique. Dans un avenir prochain, la synthèse de chromosomes humains sera techniquement possible et, combinée aux avancées d’ingénierie de génome, des modifications majeures du génome humain pourront être effectuées. Il sera par exemple possible de rendre résitantes des cellules contre certaines maladies ou de leur ajouter de nouvelles voies métaboliques. Bien que certaines de ces applications puissent être bénéfiques dans le cadre de la recherche, il est important de se demander si de telles pratiques sont souhaitables en médecine. En 1997, lors de la 29^e session de la conférence générale de l’Organisation des Nations unies pour l’éducation, la science et la culture (UNESCO), la Déclaration universelle sur le génome humain et les droits de l’homme a été adoptée. En plus d’interdire le clonage humain destiné à la reproduction, cette déclaration vise aussi à protéger la dignité du génome humain. Durant cette même conférence, la Déclaration sur les responsabilités des générations présentes envers les générations futures a aussi statué que le génome humain doit être protégé et sa biodiversité sauvegardée. Ces déclarations ne demandent pas de limiter la recherche, mais plutôt de l’exercer avec prudence. L’utilisation de sujets humains n’est pas une option à considérer, même si certaines modifications pourraient sembler avantageuses à court terme. En effet, une telle pratique pourrait diminuer la diversité génétique humaine et ainsi affecter l’adaptabilité de notre espèce à long terme.

Bien que les techniques de synthèse de chromosomes permettent, en principe, la création de nouvelles séquences génomiques inédites, les projets rapportés à ce jour demeurent très fortement inspirés des organismes retrouvés dans la nature. Les séquences, la composition en gènes et l’architecture des chromosomes n’ont en effet pas encore fait l’objet d’un grand nombre de modifications qui, collectivement, permettront de faire émerger les principes fondamentaux régissant l’ingénierie des génomes. Lorsque ces principes de base seront mieux compris, des efforts de conception rationnelle pourront plus facilement être entrepris, en intégrant des outils informatiques de modélisation cellulaire et de conception assistée par ordinateur. Ces outils permettront non seulement de prédire efficacement les phénotypes attendus, mais aussi d’établir l’architecture détaillée des chromosomes. Ces génomes pourront être organisés en modules regroupant des fonctions communes, qui seront combinés selon les besoins spécifiques de l’organisme désiré. Les cellules produites pourront ainsi contenir des gènes recodés, utilisant des codons synonymes ou n’existant pas dans la nature (Figure 3), ou inclure diverses machineries cellulaires spécialisées ou des combinaisons de voies métaboliques actuellement inexistantes. Une variété d’applications pourront alors être envisagées comme la production de molécules d’intérêt, la bioremédiation, le traitement de maladies ou encore la création de vaccins plus efficaces.

Figure 3. Les génomes synthétiques du futur. Les progrès de la génomique synthétique mèneront à des génomes ayant des propriétés différentes de celles observées dans la nature. Le développement de nucléotides synthétiques et l’utilisation de codes génétiques alternatifs permettront de créer des cellules artificielles dont le matériel génétique ne correspond à aucun autre organisme retrouvé dans la nature.

Figure 3. Les génomes synthétiques du futur. Les progrès de la génomique synthétique mèneront à des génomes ayant des propriétés différentes de celles observées dans la nature. Le développement de nucléotides synthétiques et l’utilisation de codes génétiques alternatifs permettront de créer des cellules artificielles dont le matériel génétique ne correspond à aucun autre organisme retrouvé dans la nature.

Un autre axe en développement vise à créer des organismes utilisant des nucléotides non-canoniques dans leur génome (Figure 3). Ceci permettrait non seulement de distinguer les organismes synthétiques des organismes naturels, mais également de leur conférer des caractéristiques intéressantes [50] (→).

(→) Voir la Chronique génomique de B. Jordan, m/s n° 2, février 2018, page 179

Un avantage de cet ADN artificiel est qu’il impose une dépendance à des nucléotides n’existant pas naturellement, limitant ainsi la dissémination dans l’environnement des organismes génétiquement modifiés. L’utilisation de nouvelles bases azotées pour la synthèse de l’ADN [53] (→) implique l’écriture de nouveaux codes génétiques, ce qui permettra d’immuniser l’organisme contre les virus utilisant des codes naturels. Cette approche permettra également de limiter l’expression de gènes acquis lors de potentiels évènements d’échange de matériel génétique par transfert horizontal entre organismes naturels et synthétiques. L’incompatibilité entre les codes naturels et synthétiques serait à l’origine d’erreurs de traduction des protéines, en causant des interruptions précoces ou en menant à l’incorporation d’acides aminés inappropriés. Des acides aminés non-naturels pourraient être incorporés par certains de ces codons non-utilisés ou synthétiques, offrant ainsi des capacités structurales ou enzymatiques améliorées pour diverses protéines. Une souche de la bactérie E. coli possédant des nucléotides non-naturels a déjà été produite [51] et des souches utilisant un code génétique réduit sont disponibles [21, 22].

(→) Voir la Chronique génomique de B. Jordan, m/s n° 5, mai 2019, page 483

Les avancées technologiques spectaculaires des dernières années nous permettent d’assister aux prémices de l’ère de la génomique synthétique. Les défis sont encore nombreux avant d’atteindre le plein potentiel de cette discipline émergente, mais il est probable qu’elle transformera la recherche fondamentale et appliquée dans un futur proche [66] (→). La capacité de synthèse massive d’ADN promet également d’accélérer les recherches en sciences biologiques en plus de constituer un outil important en biologie de synthèse pour répondre aux multiples obstacles auxquels l’humanité devra faire face au cours de ce siècle.

(→) Voir la Synthèse de F. Labroussaa et al., page 761 de ce numéro

Les auteurs déclarent n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article.