Vignette (Photo © Charlotte Vernisse).

Les pathologies pulmonaires chroniques comme l’asthme, la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) ou la fibrose pulmonaire primitive, représentent un lourd fardeau en santé publique avec plus de 3 millions de morts par an dans le monde [1]. Cependant, il n’existe aucun traitement curatif à ce jour. La mise au point de modèles pouvant reproduire la complexité architecturale et les fonctionnalités du poumon sont donc un enjeu médical majeur.

Les premiers modèles qui ont contribué à la connaissance du développement, de l’homéostasie et des pathologies du système respiratoire, en dehors des modèles animaux, ont été les cultures organotypiques in vitro de tissu pulmonaire [2]. L’avènement plus récent des organoïdes offre un modèle supplémentaire qui pourrait constituer un tournant dans la modélisation des maladies pulmonaires chroniques et pourrait très significativement accélérer le développement de nouvelles thérapies. Les organoïdes sont de petits systèmes biologiques structurés en 3 dimensions (3D), résultats de l’auto-organisation des cellules. Ces structures miment in vitro, au moins en partie, le développement et la fonction d’un organe en miniature. Ils reproduisent la complexité des types cellulaires et l’organisation de l’organe.

Les premiers organoïdes pulmonaires ont été obtenus à partir de cellules fœtales [3] mais c’est grâce aux cellules souches pluripotentes (CSP) [4] et notamment aux cellules souches pluripotentes induites humaines (iPS), que leur utilisation a été popularisée, offrant de nouvelles perspectives.

Bien que la définition des organoïdes implique une structure en 3D, la fonction pulmonaire d’interface ouverte sur le milieu extérieur peut être modélisée en 2D de façon légitime, puisqu’une telle organisation est inscrite dans l’architecture de la paroi de la trachée, des bronches, des bronchioles ou des alvéoles. C’est pourquoi cette revue décrira non seulement les organoïdes pulmonaires 3D mais également les épithéliums bronchiques cultivés en 2D, dont les mises au point ont précédé et accompagné celles des structures en 3D.

L’arbre respiratoire intra-thoracique adulte se divise en deux zones de compositions architecturales et cellulaires bien distinctes qui répondent à deux impératifs fonctionnels différents : 1) les voies aériennes de conduction (trachée, bronches et bronchioles) pour le transport et la filtration de l’air, et 2) la zone des échanges gazeux (bronchioles respiratoires, canaux alvéolaires, alvéoles) pour l’apport d’oxygène et l’élimination de gaz carbonique. Ces fonctions requièrent un haut degré de spécialisation cellulaire. La trachée, les bronches et les bronchioles constituent des épithéliums cylindriques ou cubiques formant les voies aériennes. Elles garantissent l’humidification de l’air et la protection des zones distales contre les particules inhalées et les agents pathogènes grâce, d’une part aux cellules à mucus (ou cellules caliciformes) sécrétant le mucus qui capte ces mêmes particules, et, d’autre part, aux cellules ciliées qui en assurent la clairance. Les cellules basales sont les progéniteurs de cet épithélium pseudostratifié. Les cellules neuroendocrines, moins nombreuses, régulent la réponse épithéliale face à des stimulus physiologiques, tels que l’hypoxie, tandis que les ionocytes, nouvellement découverts, sont responsables d’une forte activité de transport d’ions chlorures reposant sur la protéine membranaire CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), un canal chlorure dont des mutations sont à l’origine de la mucoviscidose [5]. La fonction de l’épithélium est modulée par la proportion de ces différents types cellulaires, qui varie le long de l’arbre bronchique avec une augmentation de certaines populations rares au niveau des bronchioles terminales, comme les cellules Club qui sécrètent des glycosaminoglycanes et des peptides antimicrobiens. La fonction ventilatoire est réalisée au niveau des sacs alvéolaires grâce aux pneumocytes de type 1 qui tapissent l’alvéole et permettent les échanges gazeux par diffusion avec les capillaires sous-jacents. Les pneumocytes de type 2 synthétisent le surfactant, essentiel pour réduire la tension de surface au niveau des alvéoles. Ils jouent également le rôle de cellules souches et sont capables de se différencier en pneumocytes de type 1.

Cette organisation étagée et complexe est le fruit d’un long développement qui commence dès le début de la période embryonnaire et s’étend jusqu’à plusieurs années après la naissance. On distingue 5 phases de développement, chacune correspondant à des degrés supérieurs de ramification de l’arbre respiratoire : embryonnaire, pseudo-glandulaire, canaliculaire, sacculaire et alvéolaire. La compréhension de la phase embryonnaire est particulièrement instructive pour la mise au point des protocoles de différenciation des cellules souches pluripotentes en épithélium bronchique. Cette phase débute par la mise en place de l’endoderme définitif, qui devient l’intestin primitif et se subdivise en 3 sections selon un axe antéro-postérieur. L’activation de la voie Activine/Nodal est essentielle pour le déroulement de cette étape. Une invagination se forme ensuite au niveau de l’intestin primitif antérieur. Ce bourgeon endodermique envahit alors le mésoderme environnant avec lequel il entretiendra des relations étroites tout au long du développement pulmonaire. Ce bourgeon apparaît dans la partie ventrale de l’intestin primitif antérieur, région caractérisée par l’expression du facteur de transcription NKX2.1 (aussi nommé thyroid transcription factor 1 ou TTF-1), sous l’influence de l’inhibition des voies de signalisation du TGF-β (transforming growth factors β) et des protéines morphogénétiques osseuses (BMP, pour bone morphogenetic protein). Les progéniteurs pulmonaires exprimant NKX2.1 suivent ensuite un schéma de différenciation selon un gradient proximo-distal sous l’effet de facteurs de croissance, tels que BMP4, FGF (fibroblast growth factor) et WNT, pour donner naissance à l’arbre bronchique proximal et aux alvéoles distales [6]. Le processus d’alvéolisation débute quelques semaines avant la naissance pour s’achever après l’adolescence [7].

Les modèles animaux ont longtemps été la méthode de choix pour étudier le développement pulmonaire, simuler et prédire la réponse biologique face à des agressions externes afin d’anticiper des succès pharmacologiques chez l’homme. Ils ont permis des avancées considérables dans ce domaine [8], mais ces modèles, en plus d’être coûteux, longs et fastidieux à mettre en place, ne sont pas toujours prédictifs des réponses chez l’homme [9] (→).

(→) Voir la Synthèse de H. Hardin-Pouzet et S. Morosan, m/s n° 2, février 2019, page 153

En effet, il existe des différences structurelles entre le poumon humain et celui des rongeurs. Par exemple, les cellules basales qui permettent le renouvellement épithélial tout au long des voies aériennes chez l’homme, ne sont présentes que dans la trachée chez la souris [10]. Les cellules à mucus sont également moins fréquentes dans les modèles murins [11]. Chez les souris et les rats, la production de surfactant apparaît déjà en place dès le stade sacculaire [12] alors que la maturation des pneumocytes de type 2 dont le surfactant est issu, est bien plus tardive chez l’homme.

Les CSP, les cellules souches embryonnaires humaines ou les cellules souches pluripotentes induites humaines (iPS) sont une source alternative très prometteuse [25]. En effet, les CSP ont un potentiel d’auto-renouvellement illimité et peuvent se différencier vers tous les types cellulaires, y compris ceux du système respiratoire. Plusieurs protocoles de culture 2D d’épithéliums respiratoires dérivés de CSP ont été publiés [26-28]. Ils reproduisent in vitro les conditions du développement embryonnaire du système respiratoire, intégrant les étapes d’endoderme définitif, d’intestin primitif antérieur ventralisé, puis de progéniteurs pulmonaires (Figure 2), et permettent d’obtenir des épithéliums constitués des principaux types cellulaires bronchiques ou alvéolaires (pour une revue, voir [7]).

Figure 2. Étapes-clés des protocoles de différenciation pulmonaire à partir de cellules souches pluripotentes, mimant in vitro le développement de l’épithélium respiratoire. iPS : cellules souches pluripotentes induites.

Figure 2. Étapes-clés des protocoles de différenciation pulmonaire à partir de cellules souches pluripotentes, mimant in vitro le développement de l’épithélium respiratoire. iPS : cellules souches pluripotentes induites.

Les CSP permettent également de produire des organoïdes 3D. Certaines équipes réalisent les premières étapes de différenciation en culture monocouche 2D [29-32]. Les progéniteurs pulmonaires exprimant NKX2.1 sont ensuite purifiés grâce à des marqueurs membranaires qui leur sont spécifiques – CPM (carboxypeptidase M)⁺ ou CD47^high/CD26^low – avant d’être mis en culture en 3D dans du Matrigel. D’autres équipes préfèrent induire la culture en 3D juste après le stade d’endoderme définitif, passant par un stade de précurseurs organisés en sphéroïdes avant d’induire la structure organoïde [33-35]. L’une des grandes difficultés rencontrées par les équipes travaillant sur la différenciation des CSP en tissu bronchique réside dans le degré de maturité de l’épithélium obtenu : l’aspect morphologique et les données transcriptomiques montrent ainsi souvent des caractéristiques équivalentes à celles de poumons fœtaux [36]. Cet écueil peut-être contourné par la transplantation des cellules dans une souris immunodéficiente afin d’achever la maturation de ces organoïdes in vivo, à condition d’y associer, avant la greffe, une niche bioartificielle synthétique en PLG (poly(lactide-co-glycolide)) [34]. L’implémentation du milieu commercial Pneumacult^TM , initialement destiné à la culture de cellules primaires bronchiques en ALI, permet également d’obtenir in vitro des organoïdes présentant de nombreuses cellules multi-ciliées suffisamment matures pour permettre des études portant sur les battements ciliaires [30].

D’autres protocoles se concentrent sur la différenciation du compartiment alvéolaire au sein des organoïdes [29, 32]. Ces alvéolo-sphères produisent du surfactant (SFPC), et les cellules qui les constituent présentent des profils d’expression génique proches de celui des pneumocytes de type 2 et possèdent des corps lamellaires.

Certaines problématiques restent néanmoins à résoudre, comme l’absence de modélisation de l’interface entre l’épithélium et le tissu sous-jacent (cellules endothéliales et fibroblastiques/mésenchymateuses) au sein des organoïdes. Même si un compartiment de nature mésenchymateuse est parfois présent dans ces modèles, il n’atteint jamais le stade de cellule endothéliale, y compris après greffe in vivo [33, 36]. Il sera donc très utile de complexifier le modèle en y intégrant un véritable compartiment mésenchymateux.

Le poumon est un organe complexe et diversifié, tant sur le plan cellulaire que sur le plan structurel. Cette revue des différents modèles d’organoïdes pulmonaires en est le reflet : diversité des sources cellulaires, diversité des architectures, diversité des applications (Figure 3). Les modèles en 2D sont privilégiés pour leur facilité d’utilisation et de suivi. Les modèles en 3D sont eux préférés pour leur pertinence histologique. Par rapport aux autres sources cellulaires, les CSP donnent accès à tous les stades développementaux et permettent une production quasi infinie d’organoïdes. Associées à la technologie CRISPR, ces cellules offrent ainsi une palette de modèles illimitée. Les pistes d’amélioration des organoïdes pulmonaires intègreront certainement la complexification du modèle avec, en particulier, l’implémentation de vaisseaux, de nerfs, de cellules immunitaires, etc. pour tendre à un système in vitro le plus complet possible. Le rôle architectural et paracrine joué par les vaisseaux au cours du développement [43] et de la réparation du poumon est en effet majeur. Outre les « lung on a chip » que nous avons évoqués, les co-cultures avec des cellules mésenchymateuses et endothéliales avant greffe chez l’animal immunodéprimé [44] pourraient être une solution. L’amélioration continue des matériaux biocompatibles, notamment des hydrogels modulables à souhait et photo-polymérisables, favorisera très probablement la production de vaisseaux dans ces organoïdes pulmonaires [45]. L’ensemble de ces avancées technologiques seront, sans conteste, à l’origine de grands progrès en pneumologie.

Figure 3. Sources cellulaires, types et applications des organoïdes pulmonaires. CSE : cellules souches embryonnaires ; iPS : cellules souches pluripotentes induites.

Figure 3. Sources cellulaires, types et applications des organoïdes pulmonaires. CSE : cellules souches embryonnaires ; iPS : cellules souches pluripotentes induites.

Les auteurs déclarent n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article.

Nous remercions la Fondation pour la recherche médicale pour son soutien (financement FDM20170638083).