Vignette (Photo © Olivier Goureau).

La possibilité de reprogrammer les cellules somatiques en cellules souches induites à la pluripotence (cellules iPS) et d’orienter ensuite ces cellules vers un destin cellulaire spécifique a ouvert un nouveau champ de recherches pour l’étude du développement anténatal humain, et celle des maladies humaines [1]. Les progrès concernant notre compréhension des programmes de développement, notamment grâce à la disponibilité de modèles animaux, et la maîtrise des protocoles in vitro de différenciation contrôlée des cellules souches pluripotentes humaines, permettent depuis quelques années de produire des structures tridimensionnelles présentant une organisation cellulaire et des propriétés proches de celle des organes. La formation de ces structures complexes, appelées organoïdes, repose sur la remarquable capacité des cellules souches pluripotentes à s’auto-organiser spatialement au cours de leur différenciation [2, 3] (→).

(→) Voir la Synthèse de J.L. Galzi et al., m/s n° 5, mai 2019, page 467

Si la fonctionnalité des organoïdes rétiniens obtenus à partir des protocoles actuels reste limitée en raison d’une relative immaturité, la rétinogenèse est en revanche assez fidèlement reproduite [4, 5]. Ces nouveaux modèles sont donc très intéressants pour l’étude du développement de la rétine dans un contexte humain et ouvrent de nouveaux champs d’investigation pour comprendre des maladies de la rétine difficilement modélisables chez l’animal, ainsi que des perspectives encourageantes dans le domaine de la thérapie cellulaire ou le criblage de molécules thérapeutiques.

Les connaissances concernant le développement oculaire sont indispensables pour l’établissement de protocoles permettant de guider la différenciation des cellules souches pluripotentes humaines en cellules rétiniennes en conduisant à la formation d’organoïdes de rétine.

Au cours de l’embryogenèse, la rétine neurale et l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dérivent du neurectoderme, la cornée et le cristallin de l’ectoderme de surface, et la sclère du mésoderme. La formation de l’œil s’amorce lors de la gastrulation par une série d’événements structuraux régis par des signaux moléculaires spécifiques qui confèrent à un groupe de cellules du neuroépithélium médian et antérieur une identité oculaire [6]. La délimitation de ce territoire dépend de l’activation des voies de signalisation du facteur de croissance des fibroblastes (FGF), du facteur de croissance apparenté à l’insuline (IGF-1) et de la répression de deux autres voies de transduction : la voie commune au facteur de croissance transformant bêta (TGF-β) et aux protéines morphogénétiques osseuses (BMP) et celle impliquant la signalisation du ligand Wnt (Figure 1A). La mise en place de ce territoire est orchestrée par la régulation temporelle et spatiale de gènes codant des facteurs de transcription spécifiques appelés « facteurs de transcription du champ oculaire » [6, 7] : six protéines homeobox différentes (LHX2, OTX2, PAX6, RAX, SIX3 et SIX6)¹, un récepteur nucléaire (NR2E1 [nuclear receptor subfamily 2 group E member 1], aussi appelé TLX, pour tailless) et une protéine T-box (TBX3 pour T-box transcription factor 3). Sous l’influence de différents signaux, cette région va se scinder en deux pour former deux zones symétriques latérales. Ce remodelage se traduit par une évagination du neuroépithélium conduisant à la formation des vésicules optiques qui formeront, par la suite, la rétine et le nerf optique. Une étape d’invagination de ce neuroépithélium donnera naissance à la cupule optique, constituée désormais de deux couches (Figure 1B). Ces couches externe et interne formeront respectivement l’EPR et la neurorétine (aussi appelée rétine neurale) sous l’influence de signaux exogènes provenant de tissus adjacents, tels que le FGF, des agonistes de la voie TGF-β/BMP et le morphogène Sonic hedgehog (Shh) (Figure 1C). À ce stade, la future neurorétine est constituée de progéniteurs rétiniens multipotents, capables de donner naissance à tous les types cellulaires rétiniens selon une séquence temporelle qui est similaire chez tous les vertébrés [8]. Les types cellulaires précoces, comme les cellules ganglionnaires, les cellules amacrines et les cellules horizontales², apparaissent tôt au cours du développement, tandis que les photorécepteurs, les cellules bipolaires et les cellules gliales de Müller sont générés à un stade plus avancé (Figure 1D–E).

Figure 1. Les étapes du développement de la rétine des vertébrés. Au stade très précoce (A), sous l’influence de plusieurs gradients de facteurs morphogéniques, un territoire antérieur et médian de la plaque neurale dorsale acquiert une « identité oculaire ». Après formation du tube neural, ce territoire va se scinder en deux (B) et s’évaginer pour former les vésicules optiques. L’invagination de ces vésicules aboutit ensuite à la formation d’une structure présentant deux feuillets (C) qui formeront la future neurorétine et l’épithélium pigmentaire. À ce stade, la future neurorétine est constituée de progéniteurs multipotents (D) qui vont, par vagues successives, donner naissance aux différents types cellulaires qui constituent la neurorétine adulte (E).

Figure 1. Les étapes du développement de la rétine des vertébrés. Au stade très précoce (A), sous l’influence de plusieurs gradients de facteurs morphogéniques, un territoire antérieur et médian de la plaque neurale dorsale acquiert une « identité oculaire ». Après formation du tube neural, ce territoire va se scinder en deux (B) et s’évaginer pour former les vésicules optiques. L’invagination de ces vésicules aboutit ensuite à la formation d’une structure présentant deux feuillets (C) qui formeront la future neurorétine et l’épithélium pigmentaire. À ce stade, la future neurorétine est constituée de progéniteurs multipotents (D) qui vont, par vagues successives, donner naissance aux différents types cellulaires qui constituent la neurorétine adulte (E).

Outre leur intérêt pour étudier le développement humain, les organoïdes rétiniens représentent une source très intéressante de cellules d’intérêt thérapeutique. Dans une démarche de médecine dite régénérative, ou thérapie cellulaire, on peut envisager la production de cellules spécifiques qui pourraient être implantées chez des patients souffrant d’une perte de ces cellules. Des publications récentes décrivent la transplantation dans différents modèles animaux de photorécepteurs issus d’organoïdes, en suivant différentes stratégies [5, 22-25]. Certaines approches consistent à transplanter une population purifiée de photorécepteurs immatures, après une étape de sélection (tri cellulaire par cytométrie en flux ou magnétique) [22, 24] ; d’autres proposent la greffe d’un feuillet de rétine issu d’organoïdes rétiniens dans des modèles animaux où l’ensemble des photorécepteurs ont dégénéré [24, 25]. Toutefois, la capacité des photorécepteurs greffés à se reconnecter dans le tissu hôte est très réduite en raison de la présence, au sein de ces feuillets, de cellules rétiniennes autres que les photorécepteurs. Quelle que soit la stratégie employée, la capacité limitée des cellules greffées à se développer en photorécepteurs fonctionnels (sensibles à la lumière) connectés à la fois à la rétine interne et à l’EPR de l’hôte reste un obstacle majeur. De nouvelles voies de recherche, visant à combiner la thérapie cellulaire et l’optogénétique ou la bio-ingénierie (polymères structuraux biocompatibles ou échaffaudages [scaffold]), commencent à émerger. L’utilisation de scaffold a pour but de favoriser la maturation et la polarisation des photorécepteurs afin de transplanter des photorécepteurs avec des segments externes sensibles à la lumière [26]. L’approche optogénétique permet de rendre les cellules artificiellement sensibles à la lumière, grâce à l’expression d’opsines³ microbiennes spécifiques, même en l’absence de maturation fonctionnelle des photorécepteurs [27].

Dans la mesure où les organoïdes peuvent être obtenus à partir de cellules iPS de patients atteints de maladies génétiques, ils peuvent être utilisés pour comprendre le processus pathologique conduisant à la maladie, et comme outil pour le développement de nouvelles thérapies pharmacologiques ou géniques.

Concernant les maladies de la rétine, la technique des cellules iPS est particulièrement intéressante dans le cas des maladies dégénératives héréditaires, telles que les rétinites pigmentaires. Bien que des modèles murins puissent être utilisés pour étudier certains aspects de ces maladies, ils ne présentent pas toujours les signes cliniques de la maladie ou ne reproduisent pas fidèlement le processus pathologique, et leur rétine ne possèdent pas toutes les caractéristiques d’une rétine humaine. Ainsi, les cellules iPS obtenues à partir de patients ont permis de produire des organoïdes présentant des phénotypes pathologiques, comme une perte prématurée des photorécepteurs comparable à celle observée chez les sujets atteints [28]. Ces organoïdes sont aujourd’hui utilisés pour comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de la mort des photorécepteurs menant à la cécité chez les patients.

L’accès à des biopsies de patients volontaires n’est pas toujours facile, notamment pour les maladies rares. La nouvelle technique d’édition du génome CRISPR/Cas9 peut permettre aujourd’hui de s’en affranchir. La palette d’outils liée à cette technique rend en effet possible la modification ciblée, in vitro, du génome pour reproduire au sein de cellules iPS « normales » des mutations connues pour être responsables de maladies [29], et ainsi de générer des organoïdes rétiniens porteurs de mutation(s) avec un phénotype pathologique. Il est aussi possible d’utiliser cette technique pour corriger le(s) mutation(s) et valider la réversion d’un phénotype au sein des organoïdes [29, 30].

Une autre application intéressante consiste à utiliser des organoïdes de rétine pour le criblage automatisé à haut débit de centaines de milliers de composés chimiques, afin d’identifier des molécules d’intérêt « thérapeutique », à une échelle qui ne pourrait pas être réalisée sur des modèles animaux. Toutefois, le défi de miniaturisation et d’automatisation reste important en raison de la complexité des cultures d’organoïdes (longues étapes de différenciation, traitements nécessaires pour l’imagerie, etc.).

Malgré les similitudes qui ont pu être obtenues entre les organoïdes rétiniens et une rétine adulte, les niveaux d’organisation et de fonctionnalité de ces deux entités sont loin d’être identiques ; ce qui est tout à fait compréhensible étant donné les différences marquées entre les environnements in vitro et in vivo. Des améliorations futures pourraient reposer sur l’enrichissement des systèmes de culture. Par exemple, les organoïdes rétiniens isolés ne forment pas une véritable cupule optique et ne présentent pas un EPR correctement localisé, en face des photorécepteurs. La coculture d’organoïdes en présence d’EPR pourrait améliorer la morphogenèse des segments externes des photorécepteurs [31] et, au final, leur fonction (réponse à la lumière), ou permettre de modéliser des maladies caractérisées par des défauts d’interaction entre ces deux tissus. Les organoïdes ne sont pas non plus reliés au cerveau antérieur, ou à d’autres structures non-rétiniennes importantes pour le développement rétinien. Le maintien de connexions rétine-cerveau par l’intermédiaire de cocultures (ou « assembloïdes ») d’organoïdes rétiniens et d’organoïdes cérébraux pourrait faciliter la survie des cellules ganglionnaires et ainsi permettre la formation d’une structure semblable au nerf optique.

Une des limites des protocoles développés pour la formation des organoïdes de rétine, comme pour ceux utilisés pour les organoïdes cérébraux, est qu’ils dirigent les cellules iPS dans un lignage neurectodermique, en inhibant la formation du mésoderme et de l’endoderme. Les organoïdes rétiniens ne présentent donc pas la combinaison complète de cellules dérivées des différentes couches germinales qui sont présentes in vivo dans une rétine, telles que les cellules microgliales et les cellules vasculaires. Cette absence de vascularisation des organoïdes rétiniens limite ainsi le soutien métabolique au centre des structures à des stades avancés (lorsque leur taille est supérieure à 250 µm) et pourrait expliquer la nécrose observée, au fil du temps, au cœur des organoïdes. Des approches de cocultures avec des cellules vasculaires, ou de bio-ingénierie tissulaire (échafaudages biologiques, bio-impression, etc.) pourraient permettre la formation de néo-vaisseaux dans les organoïdes. Une approche alternative peut être la greffe de ces organoïdes produits in vitro dans un animal hôte, qui permettra l’approvisionnement en nutriments dans un environnement adéquat, comme cela a été rapporté récemment pour des organoïdes cérébraux [32].

L’ensemble de ces considérations doit être pris en compte, notamment pour les approches de modélisation, qui, par définition, cherchent à reproduire le plus fidèlement possible la situation naturelle in vivo. À titre d’exemple, la distribution spatiale particulière des différents sous-types de photorécepteurs chez l’homme, qui se caractérise par un regroupement des cônes au sein de la partie centrale de la rétine, dans la région maculaire (ou fovéa), n’est actuellement pas observée dans les organoïdes rétiniens humains.

L’émergence de protocoles fondés sur la différenciation des cellules iPS en organoïdes de rétine qui regroupent, in vitro, les principaux évènements moléculaires et cellulaires de la rétinogenèse humaine a ouvert d’immenses possibilités de recherche sur le développement, la modélisation et l’étude de processus pathologiques ou la production de cellules pertinentes en clinique. Encore imparfaits à ce jour, ils sont néanmoins complémentaires des modèles animaux, qui présentent d’autres avantages mais ont leurs limites. La mise au point d’assembloïdes, en combinant plusieurs types cellulaires ou d’organoïdes (rétine, cerveau, EPR, vaisseaux, etc.) constitue une piste intéressante pour le développement de modèles 3D ex vivo encore plus fidèles à la réalité complexe in vivo.

Les auteurs déclarent n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article.