Le dispositif utilisé pour mesurer la force et le déplacement élémentaire (ou « pas ») de la kinésine est schématisé sur la partie gauche de la Figure 2 [ 13]. Une bille piégée dans un faisceau lumineux est recouverte de quelques molécules de kinésine et mise en contact avec un microtubule. La pince optique se comportant mécaniquement comme un ressort linéaire, le déplacement de la bille par rapport au centre du piège est proportionnel à la force produite par la molécule de kinésine. Une pince de faible rigidité (≈ 0,02 pN/nm) est utilisée lorsque l’on veut mesurer le déplacement élémentaire de la kinésine à charge nulle. La force maximale est mesurée en utilisant une pince optique plus rigide.

Figure 2. Schéma de la pince optique permettant l’étude d’un moteur moléculaire tel que la kinésine ou l’ARN polymérase II. A. La kinésine, un dimère comportant deux domaines moteurs globulaires (en orange) et une longue hélice α (en rouge) se lie et se déplace de façon processive le long de microtubules (en bleu). La manipulation par une pince optique et l’analyse des déplacements d’une bille fixée sur l’hélice α de la kinésine permettent de mesurer la force et le déplacement produits par une molécule de kinésine. B. L’ARN polymérase II fixée à la surface d’une lamelle induit la transcription de l’ADN (en vert) en ARN messager (en rouge). L’énergie de chaque cycle d’interaction entre l’enzyme et son substrat est fournie par l’hydrolyse d’une molécule d’ATP. La kinésine et l’ARN polymérase effectuent un grand nombre de déplacement élémentaire avant de se dissocier de leur substrat. Chaque déplacement élémentaire (ou pas) du moteur moléculaire (indiqué par δX) est transmis à la bille piégée dans la pince optique.

Figure 2. Schéma de la pince optique permettant l’étude d’un moteur moléculaire tel que la kinésine ou l’ARN polymérase II. A. La kinésine, un dimère comportant deux domaines moteurs globulaires (en orange) et une longue hélice α (en rouge) se lie et se déplace de façon processive le long de microtubules (en bleu). La manipulation par une pince optique et l’analyse des déplacements d’une bille fixée sur l’hélice α de la kinésine permettent de mesurer la force et le déplacement produits par une molécule de kinésine. B. L’ARN polymérase II fixée à la surface d’une lamelle induit la transcription de l’ADN (en vert) en ARN messager (en rouge). L’énergie de chaque cycle d’interaction entre l’enzyme et son substrat est fournie par l’hydrolyse d’une molécule d’ATP. La kinésine et l’ARN polymérase effectuent un grand nombre de déplacement élémentaire avant de se dissocier de leur substrat. Chaque déplacement élémentaire (ou pas) du moteur moléculaire (indiqué par δX) est transmis à la bille piégée dans la pince optique.

Le pas élémentaire de la kinésine est de 8 nanomètres (nm), ce qui correspond à la distance entre deux monomères successifs de tubuline. Chaque kinésine exécute une centaine de pas élémentaires à une vitesse maximale proche de 800 nm/s avant de se détacher. La force maximale développée est de 5-7 pN. Chaque pas élémentaire est associé à l’hydrolyse d’une molécule d’ATP. On pense actuellement que les deux têtes de la molécule agissent de façon coordonnée, la fixation et l’hydrolyse de l’ATP sur l’une des têtes favorisant le départ de l’ADP de l’autre tête. Ainsi, le mouvement de la kinésine sur le microtubule implique que l’une au moins des têtes de la molécule demeure attachée au microtubule.

La myosine II et la kinésine présentent de nombreuses analogies de fonctionnement. Ces deux moteurs utilisent l’ATP comme source d’énergie chimique. Leur pas élémentaire résulte d’une modification conformationnelle minime d’une partie de la molécule amplifiée par un bras de levier. L’interaction avec leur substrat est caractérisée par un cycle complexe au cours duquel le moteur moléculaire est alternativement lié puis détaché [ 16, 17]. Cependant, contrairement à la kinésine conventionnelle, la myosine est détachée de l’actine pendant la plus grande partie de son cycle d’interaction: la myosine II n’est donc pas une enzyme processive. Le déplacement du filament d’actine induit par la fixation de chaque molécule de myosine est équivalent au pas élémentaire de la myosine.

Ces caractéristiques associées à la brièveté de la durée de l’interaction imposent un dispositif expérimental particulier comportant une double pince optique [ 18]. Une bille est collée à chaque extrémité d’un filament d’actine (Figure 3). Le faisceau laser est envoyé alternativement sur chacune des deux billes, à fréquence suffisamment rapide, afin de créer une double pince optique. Une troisième bille de verre tapissée de quelques molécules de myosine est placée juste audessous du filament d’actine, de telle sorte que la myosine puisse se fixer sur l’actine. Lors de la bascule de la tête de la myosine, le déplacement et la force produits par la myosine sont transmis aux billes piégées et mesurés grâce à des détecteurs à 4 cadrans (photodiodes). L’utilisation des pinces optiques a permis de comparer les propriétés des myosines de muscles lisse, squelettique ou cardiaque. Le déplacement élémentaire de ces différentes myosines varie de 4 à 10 nm et la force élémentaire est de 3 à 6 pN. Dans le muscle lisse, cependant, les durées du déplacement et de la force exercée par la molécule de myosine sur la pince optique sont d’environ un ordre de grandeur plus grand que dans le muscle squelettique, et une bascule supplémentaire de la tête de la myosine, contemporaine du départ de l’ADP, a été observée. La caractérisation fonctionnelle des anomalies moléculaires de l’actine et de la myosine ouvre des perspectives pour la compréhension et le traitement des myopathies génétiques et acquises [ 19]. Dans notre laboratoire, nous utilisons la technique des pinces optiques pour mesurer, à l’échelon moléculaire, les cinétiques et la force des ponts actinemyosine des muscles normaux et pathologiques. Cette analyse moléculaire fonctionnelle a pour objectif principal de mieux comprendre la physiopathologie des myopathies et des cardiopathies dont l’enjeu médical et en santé publique est très important.

Figure 3. La mesure du déplacement et de la force élémentaire produit par une molécule unique de myosine musculaire nécessite un dispositif expérimental particulier comportant une double pince optique. Deux billes fixées aux extrémités d’un filament d’actine permettent sa manipulation optique. Lors de son interaction avec l’actine, la tête de la myosine bascule, produisant un déplacement élémentaire du filament d’actine et donc des billes de 4-10 nm en fonction de l’origine tissulaire de la myosine. De même, la force maximale produite varie de 3 à 6 pN. Après la bascule, la fixation d’une molécule d’ATP sur la tête de la myosine induit le détachement du pont actine-myosine. L’interaction de la myosine musculaire avec l’actine est un phénomène rapide: l’analyse du déplacement des billes et de la force produite lors de l’interaction actine-myosine nécessitent des systèmes rapides de détection (détecteurs à 4 cadrans basé sur un système de photodiodes).

Figure 3. La mesure du déplacement et de la force élémentaire produit par une molécule unique de myosine musculaire nécessite un dispositif expérimental particulier comportant une double pince optique. Deux billes fixées aux extrémités d’un filament d’actine permettent sa manipulation optique. Lors de son interaction avec l’actine, la tête de la myosine bascule, produisant un déplacement élémentaire du filament d’actine et donc des billes de 4-10 nm en fonction de l’origine tissulaire de la myosine. De même, la force maximale produite varie de 3 à 6 pN. Après la bascule, la fixation d’une molécule d’ATP sur la tête de la myosine induit le détachement du pont actine-myosine. L’interaction de la myosine musculaire avec l’actine est un phénomène rapide: l’analyse du déplacement des billes et de la force produite lors de l’interaction actine-myosine nécessitent des systèmes rapides de détection (détecteurs à 4 cadrans basé sur un système de photodiodes).