Ces 20 dernières années, l’explosion de nombreuses techniques de biologie cellulaire et moléculaire a fourni une pléthore de nouvelles pistes dans la compréhension de la physiologie et de la physiopathologie humaine et animale. Cependant, il est aussi progressivement apparu évident que la «boîte de culture» ne pouvait pas prendre pleinement la mesure de ce qui se passe à l’échelle d’un corps humain ou animal dans toute la complexité d’un fonctionnement intégré dans des boucles régulatrices et de contrôle. De ce fait, et depuis peu, les techniques expérimentales réalisées sur animal vivant et intact reprennent toute leur justification dans une recherche sophistiquée.

La microscopie réalisée in vivo, ou microscopie intravitale, est l’une de ces techniques. A ce jour, très peu de laboratoires dans le monde la développent et pourtant, en visualisant des phénomènes in situ directement chez l’animal vivant, elle est une étape ultime dans le transfert des connaissances acquises lors d’études fondamentales vers l’application à la médecine humaine [1].

Appliquée au cancer, elle est utilisée essentiellement pour l’étude de la vascularisation intratumorale. Cependant, des tentatives récentes et isolées laissent présager qu’elle devrait avoir un intérêt majeur dans l’étude des mouvements des cellules immunitaires au cours du développement d’une tumeur cancéreuse ainsi que dans celui du recrutement des métastases par les vaisseaux des tissus secondairement envahis.

La technique de microscopie intravitale consiste à observer puis enregistrer, par l’intermédiaire d’un microscope adapté, des phénomènes fluorescents, cinétiques dans l’espace et le temps, apparaissant à l’échelle d’un tissu ou d’un organe chez un animal intact, éveillé ou endormi. La souris est l’animal le plus étudié actuellement mais, selon la problématique scientifique, rat, lapin ou hamster peuvent aussi être utilisés.

Les chambres de métal et de verre

La procédure d’implantation la plus utilisée est celle qui se fait dans les chambres de métal et de verre, et particulièrement celles positionnées autour du pli de peau dorsale de la souris [3–7]. Pour mettre en place une telle chambre, la souris est anesthésiée puis suspendue à une potence par la peau du dos qui, sous le poids de l’animal, forme un pli cutané d’environ 2 cm de hauteur. L’éxérèse d’un disque de peau est réalisée dans le pan antérieur du pli, mettant ainsi en évidence la face interne du pan postérieur. La chambre de métal et de verre est alors positionnée de part et d’autre du pli dorsal de façon à ce que l’ouverture cutanée pratiquée soit placée en face des fenêtres antérieure et postérieure de la chambre (Figure 1). La fenêtre antérieure de la chambre sous laquelle apparaît la face interne du pan cutané postérieur est refermée par un verre fin. La fenêtre postérieure qui est en contact avec la face externe du pan cutané postérieur n’est pas refermée permettant ainsi le développement tridimensionnel de la tumeur. Au cours de la même séance, et afin que l’administration de molécules ou de cellules fluorescentes soit possible de façon répétée lors des séances de microscopie intravitale, un cathéter permanent est implanté à l’animal dans la jugulaire externe. Deux à trois à jours après le positionnement de la chambre de métal et de verre, et en l’absence de réaction inflammatoire patente, les cellules tumorales ou les morceaux de tumeur sont respectivement injectées ou implantés sous le verre de la fenêtre antérieure. Les tumeurs utilisées le plus souvent sont des tumeurs humaines (par exemple mélanome, adénocarcinome colique humain, rhabdomyosarcome, cancer de la prostate, cancer du sein ou gliome malin) implantées dans des souris immunitairement déficientes. Cependant, des tumeurs murines implantées chez des souris syngéniques sont de plus en plus fréquemment utilisées (comme la lignée B16 de mélanome murin implantée chez la souris C57/Bl6 ou les lignées d’adénocarcinome mammaire murin [TS/A ou HCa-1], etc.).

Figure 1. Chambre dorsale de métal et de verre. C’est dans une chambre transparente de métal et de verre greffée chirurgicalement sur le dos de l’animal qu’est le plus souvent implantée la suspension de cellules tumorales ou la tumeur déjà organisée destinée à être étudiée par microscopie intravitale. Cette chambre est constituée de deux parois de titane, symétriques, centrées chacune par une fenêtre se faisant vis-à-vis. Un pli est formé par l’étirement de la peau du dos de la souris. Un des deux pans de ce pli est enlevé chirurgicalement sur une surface correspondant à la taille des fenêtres de la chambre. Les deux parois de la chambre sont alors positionnées et fixées de part et d’autre du pli cutané. A travers une des deux fenêtres de la chambre apparaît la face souscutanée interne du pan postérieur du pli cutané. C’est dans cette fenêtre dite d’observation que sont déposées les cellules tumorales avant qu’elle soit refermée par un verre. Un cathéter jugulaire permanent est implanté à la souris afin de pouvoir injecter les produits fluorescents nécessaires à l’étude par microscopie intravitale.

Figure 1. Chambre dorsale de métal et de verre. C’est dans une chambre transparente de métal et de verre greffée chirurgicalement sur le dos de l’animal qu’est le plus souvent implantée la suspension de cellules tumorales ou la tumeur déjà organisée destinée à être étudiée par microscopie intravitale. Cette chambre est constituée de deux parois de titane, symétriques, centrées chacune par une fenêtre se faisant vis-à-vis. Un pli est formé par l’étirement de la peau du dos de la souris. Un des deux pans de ce pli est enlevé chirurgicalement sur une surface correspondant à la taille des fenêtres de la chambre. Les deux parois de la chambre sont alors positionnées et fixées de part et d’autre du pli cutané. A travers une des deux fenêtres de la chambre apparaît la face souscutanée interne du pan postérieur du pli cutané. C’est dans cette fenêtre dite d’observation que sont déposées les cellules tumorales avant qu’elle soit refermée par un verre. Un cathéter jugulaire permanent est implanté à la souris afin de pouvoir injecter les produits fluorescents nécessaires à l’étude par microscopie intravitale.

L’étude par microscopie intravitale de la tumeur se développant dans la chambre est ainsi rendue possible de façon répétée (pendant environ 1 mois avec les chambres dorsales) et atraumatique pour l’animal. Lors de l’examen par microscopie, l’animal est soit endormi, soit simplement immobilisé dans un tube avant d’être placé sous les objectifs du microscope (Figure 2).

Figure 2. Plate-forme de microscopie intravitale. La souris porteuse de la chambre dorsale dans laquelle se développe la masse tumorale est immobilisée dans un tube de plexiglas. La chambre est positionnée dans une fente de la paroi du tube, ce qui la place à l’extérieur de celui-ci. La fenêtre d’observation est placée sous les objectifs du microscope à fluorescence qui est relié à une caméra de haute sensibilité. Un magnétoscope enregistre les événements fluorescents visibles par ailleurs, en direct, sur un écran de télévision (schéma adapté de [45]).

Figure 2. Plate-forme de microscopie intravitale. La souris porteuse de la chambre dorsale dans laquelle se développe la masse tumorale est immobilisée dans un tube de plexiglas. La chambre est positionnée dans une fente de la paroi du tube, ce qui la place à l’extérieur de celui-ci. La fenêtre d’observation est placée sous les objectifs du microscope à fluorescence qui est relié à une caméra de haute sensibilité. Un magnétoscope enregistre les événements fluorescents visibles par ailleurs, en direct, sur un écran de télévision (schéma adapté de [45]).

La technique de microscopie intravitale proprement-dite

Appliquée à la pathologie cancéreuse, cette technique est surtout utilisée pour l’étude du développement de la microcirculation intratumorale et des phénomènes qui se déroulent en son sein, comme l’adhérence de cellules sur la paroi vasculaire. Pour être visible à travers le microscope, les phénomènes étudiés sont rendus fluorescents. Divers types de marqueurs fluorescents sont utilisés selon le phénomène étudié.

Pour visualiser la microcirculation intratumorale (son développement mais aussi ses propriétés hémodynamiques), des marqueurs plasmatiques, comme le dextran marqué à la fluorescéine (FITC-dextran), sont utilisés. Des vaisseaux de très petit calibre (moins de 5 micromètres de diamètre) qui ne sont pas visibles par transillumination sous le microscope (Figure 3A) bénéficient ainsi de l’utilisation de la fluorescence (Figure 3B). Le poids moléculaire des marqueurs est choisi précisément pour ne pas diffuser à l’extérieur du vaisseau.

Figure 3. Images obtenues par microscopie intravitale. A. Microcirculation visualisée par transillumination. B. Microcirculation après injection d’un marqueur fluorescent plasmatique, le dextran marqué à la fluorescéine. La comparaison entre A et B illustre l’avantage de l’utilisation de marqueurs fluorescents qui dessinent et rendent visibles des vaisseaux qui sont imperceptibles lorsqu’ils sont étudiés par simple transillumination. C. L’injection d’un marqueur nucléaire fluorescent, comme la rhodamine 6G, permet de visualiser sous le microscope les cellules sanguines nucléées circulantes et de suivre leur passage et leur comportement dans le vaisseau.

Figure 3. Images obtenues par microscopie intravitale. A. Microcirculation visualisée par transillumination. B. Microcirculation après injection d’un marqueur fluorescent plasmatique, le dextran marqué à la fluorescéine. La comparaison entre A et B illustre l’avantage de l’utilisation de marqueurs fluorescents qui dessinent et rendent visibles des vaisseaux qui sont imperceptibles lorsqu’ils sont étudiés par simple transillumination. C. L’injection d’un marqueur nucléaire fluorescent, comme la rhodamine 6G, permet de visualiser sous le microscope les cellules sanguines nucléées circulantes et de suivre leur passage et leur comportement dans le vaisseau.

Pour pouvoir étudier leur comportement dans la microcirculation intratumorale, les cellules sanguines sont rendues fluorescentes soit in vivo soit ex vivo avant d’être réinjectées à l’animal. La fluorescence in vivo est obtenue par l’injection de marqueurs fluorescents membranaires ou nucléaires (tels que la rhodamine–6G) (Figure 3C) dans la circulation générale de la souris. Des cellules naturellement fluorescentes issues d’animaux exprimant des protéines fluorescentes comme la GFP (green fluorescent protein) dans un type cellulaire défini [8] ou des cellules transfectées ex vivo par l’ADN codant pour ces protéines fluorescentes peuvent aussi être injectées à l’animal, et leur comportement étudié dans la microcirculation d’intérêt.

Les cellules tumorales peuvent aussi être rendues fluorescentes. La microscopie intravitale permet alors de suivre le développement en volume de la tumeur ou permet d’étudier la transmigration de métastases à travers les vaisseaux d’un tissu pouvant être le siège d’une localisation tumorale secondaire [9]. Les marqueurs nucléaires comme l’acridine orange sont très agressifs pour les cellules tumorales et les tuent très rapidement. Les expérimentateurs préfèrent donc utiliser de la calcéine AM ou des billes fluorescentes de très petit diamètre qui ne provoquent pas de lésions membranaires. Dans le cas où les cellules tumorales sont fluorescentes, le contraste avec les vaisseaux intratumoraux, apparaissant en sombre, suffit à visualiser le lit vasculaire intratumoral.

Une fois la souris installée sous le microscope, le marquage réalisé et l’émission fluorescente des marqueurs provoquée par l’action d’une lampe au xénon ou à mercure, les phénomènes sont filmés par une caméra fonctionnant à très bas niveau de lumière et enregistrés sur cassettes vidéo (Figures 2 et 3). L’enregistrement sur cassettes permet la mise en mémoire de l’expérience et l’analyse a posteriori d’un certain nombre de paramètres qui seront détaillés dans les chapitres suivants.

En pratique, c’est surtout à l’étude de la microcirculation intratumorale elle-même et des phénomènes qui s’y déroulent (comme l’adhérence de cellules sur la paroi vasculaire) que la microscopie intravitale est utile (Figure 4).

Figure 4. Schéma récapitulatif des phénomènes pouvant être étudiés par microscopie intravitale dans le cancer.

Figure 4. Schéma récapitulatif des phénomènes pouvant être étudiés par microscopie intravitale dans le cancer.

La vascularisation intratumorale est, depuis une dizaine d’année, un des grands thèmes de la recherche dans le domaine de la santé, parce qu’elle est essentielle au développement des tumeurs cancéreuses et, par voie de conséquence, une cible thérapeutique de choix. L’étude de la cinétique de son développement est l’un des deux grands champs d’application de la technique de microscopie intravitale.

L’étude de l’adhérence des cellules sanguines sur la paroi vasculaire est l’autre grand champ d’application de la microscopie intravitale. Une des toutes premières réactions de défense de l’organisme, lorsqu’il est agressé, consiste à recruter des cellules immunitaires compétentes sur le site de l’agression. C’est essentiellement par voie sanguine que ces cellules compétentes sont recrutées. Cette étape, qu’explore en direct et in situ la microscopie intravitale, est donc un prérequis à toute réaction inflammatoire et/ou immunitaire. De façon générale, ce recrutement se fait selon une cascade d’événements qui débute par la brève interaction ou accrochage des cellules sur la paroi endothéliale suivie de leur roulement le long de celle-ci. Une fraction de ces cellules cesse de rouler à la suite de l’activation de certaines de leurs molécules d’adhérence et adhère fermement à la paroi. L’adhérence ferme est définie par un arrêt supérieur à 30 secondes. Elle est généralement suivie de la diapédèse des cellules dans le tissu extravasculaire (pour revues, voir [26–28]). C’est l’équipe de U. von Andrian aux États-Unis qui a le mieux contribué ces dernières années à élaborer des paramètres fiables de ces phénomènes d’adhérence lorsqu’ils sont étudiés par microscopie intravitale [29–32].

Un autre champ d’application de la technique de microscopie intravitale dans la pathologie tumorale dérive de celui décrit précédemment. Il a été plus particulièrement étudié par l’équipe de A. Groom au Canada. Il s’agit de l’étude de la dissémination sanguine des métastases cancéreuses. La microscopie intravitale est capable de visualiser in situ l’étape d’adhérence des cellules métastatiques sur l’endothélium des vaisseaux de tissus qui sont le siège de localisation tumorale secondaire tel que le cerveau, le foie, etc. [37].

La microscopie intravitale a montré que l’arrêt des métastases circulantes, dans les vaisseaux de tissus secondaires, n’obéit pas au paradigme habituel de l’adhérence des neutrophiles, monocytes et lymphocytes sanguins à l’endothélium vasculaire (accrochage, roulement, activation et arrêt ferme). La taille des cellules tumorales étant beaucoup plus importante que celle des cellules sanguines, les métastases sont arrêtées tout d’abord sous l’effet de la contrainte de taille dans les plus petits vaisseaux dont elles bloquent le flux sanguin. Il s’agit des capillaires, des artérioles ou les sinusoïdes hépatiques selon la localisation. Dans ce cas précis, les cellules ne roulent pas à la surface vasculaire avant de s’arrêter. Sous l’effet de la poussée sanguine, elles se déforment [38]. Elles peuvent même éclater en plusieurs fragments de moins de 5 µm de diamètre, chacun possédant une membrane cellulaire entourant du cytoplasme. Plusieurs heures après, les cellules s’allongent un peu plus à la surface vasculaire, émettent des prolongements et débutent leur transmigration à travers la paroi endothéliale. Cette transmigration ne paraît pas endommager la paroi endothéliale. Ce n’est qu’une fois dans le tissu, et non dans le sang comme il avait été supposé, que les cellules tumorales prolifèrent. Cependant, si les cellules tumorales survivent dans la circulation, et transmigrent facilement, très peu donnent des métastases cliniques pathogènes, démontrant que l’habileté des cellules tumorales à former des tumeurs secondaires n’est pas sous la dépendance unique de leur capacité de transmigrer. Une fois dans le tissu, les cellules tumorales migrent préférentiellement autour des artérioles tissulaires [39] et dans des zones particulières selon l’organe envahi. Les mécanismes moléculaires tissulaires et/ou génétiques tumoraux qui règlent la mort, la conservation en un état quiescent ou la prolifération des cellules tumorales ayant transmigré restent entièrement à élucider. La microscopie intravitale pourrait être ici d’une aide certaine.

La microscopie intravitale peut aussi visualiser le détachement des cellules tumorales de la masse tumorale et leur passage dans la circulation sanguine. Cette transmigration rétrograde se fait en trois étapes : (1) sécrétion de protéases permettant le détachement de la membrane basale et du stroma ; (2) transport des cellules métastatiques vers les vaisseaux ; (3) transmigration rétrograde dans la circulation des vaisseaux sanguins ou lymphatiques. La visualisation de cette transmigration rétrograde, qui est bien sûr très lente, a été possible dans un travail unique et fascinant réalisé grâce à un microscope multiphotonique à utilisation intravitale [40].

Ces 10 dernières années, la technique de microscopie intravitale a complété de façon bénéfique les observations faites par étude histo-pathologique (immunohistochimie, hybridation in situ, etc.) des tumeurs cancéreuses. L’avantage majeur de cette technique par rapport à ces examens classiques est d’ajouter à l’analyse morphologique des tumeurs, des notions de fonctionnalité et de cinétique de développement. Elle n’est cependant pas sans limite. Sa limite principale, lorsqu’elle utilise un simple microscope à fluorescence, est la profondeur du tissu exploré (moins de 40 µm). L’utilisation de microscopes confocaux ou multiphotoniques a sensiblement amélioré ce défaut (400 µm de profondeur sont potentiellement visualisables par de tels appareils) [41]. Ces appareils ont aussi l’avantage de diminuer la toxicité tissulaire et l’affadissement de l’émission fluorescente. L’avenir est donc à l’avènement d’une seconde génération de microscopes utilisables in vivo qui combineront résolution spatiale, temporelle et intracellulaire, à la possibilité d’observer des organes ou des tumeurs dans toute leur profondeur [42–44]. De ces développements technologiques, il est raisonnable de penser que de nouveaux champs d’application s’ouvriront à la microscopie intravitale. Parmi eux, l’étude de la cinétique intratumorale de molécules thérapeutiques (Figure 4).

Réalisée in vivo chez l’animal, la microscopie intravitale est une des étapes ultimes dans le transfert des connaissances acquises lors d’études fondamentales vers l’application à la médecine humaine. Les observations qu’elle a permis ou permettra d’acquérir sur les vaisseaux intratumoraux, les mouvements des cellules impliquées dans la défense immunitaire de l’organisme contre la tumeur cancéreuse ou la cinétique de molécules thérapeutiques dans le tissu tumoral font espérer qu’elle sera d’un apport non négligeable en thérapie anticancéreuse traditionnelle ou en voie de développement comme la thérapie antivasculaire ou l’immunothérapie cellulaire anticancéreuse utilisant des cellules dendritiques ou lymphocytaires.

Une plate-forme de microscopie intravitale (Dr Christine M’Rini, mrini@ipbs.fr) est en fonctionnement depuis mai 2001 à l’IPBS/Cnrs, 205, route de Narbonne, 31077 Toulouse. Les auteurs remercient la Région Midi-Pyrénées, l’Association Contre le Cancer, la Ligue contre le Cancer et le Ministère de la Recherche (Programme national Génopole-exploration fonctionnelle) pour leur soutien à l’implantation de cette plateforme avec laquelle ont été obtenues les images présentées dans cet article. Les auteurs remercient aussi Françoise Viala de son aide pour l’iconographie de ce document.