L’indication majeure de la transfusion des globules rouges est la restauration ou le maintien d’une oxygénation adéquate des tissus chez les patients souffrant d’anémie chronique ou lors d’hémorragies importantes en chirurgie ou en médecine d’urgence. La connaissance des risques de transmission de germes pathogènes (hépatite B dans les années 1960, VIH, HTLV et HTLV-2 dans les années 1980 et hépatite C dans les années 1990) lors de transfusions de sang ou de dérivés sanguins a eu pour effet de réduire le nombre de donneurs potentiels, conséquence d’une sélection médicale accrue. Il reste aussi à définir la transmissibilité éventuelle des agents non conventionnels (ANC) comme les prions par transfusion. Ces risques ont stimulé, à partir des années 1980, le développement de stratégies alternatives. L’érythropoïétine (EPO) n’est généralement pas efficace lorsque la concentration d’érythropoïétine sérique du patient est déjà très élevée, et sa place dans le traitement des anémies chroniques (en dehors de celles qui accompagnent les insuffisances rénales chroniques) (→) n’est pas encore parfaitement définie. Une stratégie de transfusion sanguine autologue, notamment lors d’interventions chirurgicales programmées, a été utilisée à partir des années 1980. Des « substituts du sang », comme des transporteurs d’oxygène artificiels à base d’hémoglobine (Hb) ou des tentatives de production d’hémoglobine recombinante ont été proposés. Ces produits pourraient servir de relais, mais ne concurrencent en rien la transfusion sanguine. De plus, certains problèmes liés à leur utilisation subsistent [1, 2] comme l’auto-oxydation de l’hémoglobine en solution, ou l’effet vaso-constricteur des solutions d’hémoglobine. Il serait dès lors intéressant de trouver d’autres sources possibles de globules rouges.

(→) m/s 2002, n°5, p. 540

Le récent développement des techniques de sélection des progéniteurs hématopoïétiques immatures, et notre connaissance des facteurs de croissance ciblant spécifiquement certaines lignées cellulaires, rendent envisageable la production ex vivo de populations cellulaires hématopoïétiques à des fins de greffe (progéniteurs ou cellules souches) ou à des fins transfusionnelles (globules blancs ou précurseurs érythroïdes). Ces cellules peuvent être amplifiées à partir de la prolifération d’un tout petit nombre de cellules souches sanguines, médullaires ou placentaires. Le sang de la veine du cordon ombilical présente certains avantages par rapport aux deux autres sources : il est particulièrement riche en progéniteurs immatures. En effet, le sang prélevé d’un seul cordon contient suffisamment de progéniteurs hématopoïétiques [3] pour permettre une prise de greffe chez l’enfant [4, 5] et parfoischez l’adulte [6]. De plus, ces progéniteurs donnent naissance in vitro à des colonies de plus grande taille [7] et ont une capacité d’expansion plus importante [8] que ceux qui sont issus du sang périphérique adulte ou de la moelle osseuse adulte.

Une littérature abondante montre que la différenciation de cellules souches hématopoïétiques (CSH), notamment dans les lignées érythroïdes et granuleuses, peut être stimulée très efficacement en culture par différentes combinaisons de cytokines. Dexter et al. [9] ont été les premiers à faire état d’une possible différenciation érythroïde dans un système de culture murin à long terme. Plus récemment, Malik et al. [10] ont développé un modèle de production d’érythrocytes humains chez les sujets drépanocytaires à partir de CSH de sang de cordon, de moelle osseuse et de sang périphérique. Freyssinier et al. [11] ont proposé un protocole expérimental intéressant, mais en plusieurs étapes complexes de purification et d’amplification, permettant la prolifération en grand nombre d’une population pure de progéniteurs érythroïdes à partir de sang de cordon ou de sang périphérique.

Tirant profit de l’expérience acquise en matière de contrôle de la prolifération et de la différenciation des cellules héma-topoïétiques [12–16], notre équipe a développé un protocole d’amplification in vitro, à grande échelle, de précurseurs d’érythrocytes à partir de CSH de sang de cordon exprimant l’antigène CD34 [17], en collaboration avec H. Wajcman (Inserm U.468, Hôpital Henri Mondor, Créteil, France), M.C. Marden (Inserm U.473, Hôpital de Bicêtre, Le Kremlin-Bicêtre, France), M. Bensidhoum et D. Thierry (DPHD, Saram, IPSN, Fontenayaux-Roses, France). Les cellules ont été cultivées dans un milieu défini, selon un protocole d’amplification en trois étapes : une première étape du jour 0 au jour 7, en présence de trois cytokines, stem cell factor (SCF), ligand de Flt3 et thrombopoïétine, choisies parce qu’elles entraînent la prolifération des cellules souches primitives, suivie d’une seconde étape à nouveau de 7 jours, en présence d’EPO, d’IGF-I (insulin-like growth factor-I) et de SCF, cytokines ciblant les progéniteurs érythroïdes, puis d’une troisième étape à partir de J15, en présence d’EPO et d’IGF-I, actives sur la différenciation des précurseurs érythroïdes. Après 17 jours de culture, l’augmentation du nombre de cellules par rapport à J0 atteint en moyenne 200 000 fois (50 000 à 280 000), dont 96% sont des précurseurs érythroblastiques et 4% des réticulocytes (Figure 1). Ces conditions de culture amplifient sélectivement le compartiment des progéniteurs érythroïdes en début de culture, comme en témoigne le pic du nombre de progéniteurs érythroïdes (CFU-E, colony-forming unit-erythroid) à J10, nombre qui diminue progressivement jusqu’à devenir indétectable à J17. Dans de telles conditions d’amplification, lorsque la culture est établie à partir de 10⁶ cellules CD34⁺ de sang de cordon, la production d’hémoglobine atteint 45 g. Cette Hb est majoritairement de type fœtal et parfaitement fonctionnelle en ce qui concerne la fixation et le relargage de l’oxygène.

Figure 1. Morphologie des cellules amplifiées en culture. La différenciation érythroïde est évidente dès 7 jours de culture (70 % de cellules érythroïdes) et, à partir de J10, plus de 90 % des cellules sont de type érythroïde à un stade prédominant de pro-érythroblaste. L’érythropoïèse progresse en fonction du temps de culture et, à J17, nous obtenons 64 % d’érythroblastes basophiles, 31 % d’érythroblastes polychromatophiles et acidophiles et 4 % de cellules énucléées (barre = 10 µm).

Figure 1. Morphologie des cellules amplifiées en culture. La différenciation érythroïde est évidente dès 7 jours de culture (70 % de cellules érythroïdes) et, à partir de J10, plus de 90 % des cellules sont de type érythroïde à un stade prédominant de pro-érythroblaste. L’érythropoïèse progresse en fonction du temps de culture et, à J17, nous obtenons 64 % d’érythroblastes basophiles, 31 % d’érythroblastes polychromatophiles et acidophiles et 4 % de cellules énucléées (barre = 10 µm).

Cependant, ces cellules sont incapables, in vitro, de poursuivre leur maturation jusqu’à la production de globules rouges énucléés. Nous avons donc étudié le devenir de ces populations après leur transfusion in vivo chez des souris immunodéficientes NOD/SCID (non-obese diabetic severe combined immunodeficient), modèle animal utilisé classiquement pour l’analyse de la reconstitution in vivo de CSH humaines. Nous avons choisi de greffer les cellules obtenues au jour 10 de la culture, quisont composées de 93 % de précurseurs érythroïdes et ont encore une forte capacité de prolifération comme en témoigne leur richesse en CFU-E. Trente millions de ces cellules, incubées au préalable avec un marqueur fluorescent CFSE (carboxy fluorescein succinimidyl ester), ont été transfusées à des souris NOD/SCID irradiées de manière sublétale. On a alors observé les faits suivants : (1) les cellules CFSE⁺ étaient détectables dans le foie, la rate, la moelle, les poumons et le sang des animaux, sans être détruites ; (2) dans le sang, elles achevaient en 4 jours leur maturation terminale complète jusqu’au stade de globule rouge énucléé, maturation qui s’accompagnait d’une prolifération aboutissant à une amplification du nombre de cellules d’environ 100 fois ; (3) les cellules CFSE⁺ énucléées sont bien des globules rouges exprimant l’antigène D du système Rhésus comme le sang de cordon dont les CD34⁺ initiales étaient issues , (4) l’Hb contenue dans ces globules rouges était majoritairement de type adulte (α_2β2) et parfaitement fonctionnelle (Figure 2).

Figure 2. Maturation terminale des précurseurs érythroïdes humains transfusés. Les cellules CFSE+ circulantes du sang périphérique des souris nod/scid, négatives au LDS (colorant vital des acides nucléiques), représentatives des globules rouges (GR) énucléés humains qui auraient mûri in vivo à partir des précurseurs érythroïdes transfusés, ont été triées à J3 et à J7 après injection (C). L’analyse morphologique des cellules CFSE+/LDS- triées montre des globules rouges énucléés (D) (photos, barre = 10 µm). Par la technique de photo-dissociation par éclair laser, nous montrons que l’hémoglobine (Hb) contenue dans ces globules rouges est fonctionnelle (E) puisqu’elle présente une cinétique de recombinaison à l’O2 et au monoxyde de carbone (CO) similaire à celle de l’Hb adulte issue de sang périphérique, utilisée comme témoin (courbes pointillées).

Figure 2. Maturation terminale des précurseurs érythroïdes humains transfusés. Les cellules CFSE+ circulantes du sang périphérique des souris nod/scid, négatives au LDS (colorant vital des acides nucléiques), représentatives des globules rouges (GR) énucléés humains qui auraient mûri in vivo à partir des précurseurs érythroïdes transfusés, ont été triées à J3 et à J7 après injection (C). L’analyse morphologique des cellules CFSE+/LDS- triées montre des globules rouges énucléés (D) (photos, barre = 10 µm). Par la technique de photo-dissociation par éclair laser, nous montrons que l’hémoglobine (Hb) contenue dans ces globules rouges est fonctionnelle (E) puisqu’elle présente une cinétique de recombinaison à l’O2 et au monoxyde de carbone (CO) similaire à celle de l’Hb adulte issue de sang périphérique, utilisée comme témoin (courbes pointillées).

Nous avons confirmé l’intérêt transfu-sionnel de cette population de précurseurs érythroïdes en établissant les caractéristiques suivantes : il n’existe pas d’amplification concomitante des cellules maternelles contaminantes, les cellules lymphocytaires B CD19⁺ ou T CD3⁺ sont indétectables (< 0,1 %) ; seuls de très faibles niveaux de molécules HLA de classe I et de HLA-DR sont exprimés par un petit pourcentage de cellules (1,4 et 3,4 % respectivement) ; avantage supplémentaire, les précurseurs obtenus à J10 supportent la congélation et ne perdent pas leur capacité proliférative. L’ estimation quantitative des niveaux de production permet d’envisager une utilisation clinique de ces cellules. En effet : (1) 10⁶ cellules CD34⁺ (correspondant au 1/4 ou au 1/3 du contenu en sang recueilli de la veine ombilicale d’un cordon standard) peuvent engendrer 5 à 10 x 10⁹ précurseurs érythroïdes qui continueront ensuite leur amplification et leur différenciation in vivo après transfusion jusqu’à un total de 5 à 10 x 10¹¹ globules rouges, soit 3 à 5 fois la quantité quotidienne normale produite chez l’homme ; (2) la transfusion de précurseurs érythroïdes produits ex vivo à partir de cellules CD34⁺ de sang placentaire pourrait permettre d’apporter un support transfusionnel comparable à celui des concentrés standards de globules rouges (CG). En effet si l’on considère qu’un CG contient en moyenne 2 x 10¹² globules rouges et qu’il augmente en moyenne le taux d’hémoglobine de 1g chez le receveur, on peut estimer à 1 à 2 x 10¹⁰ le nombre de précurseurs érythrocytaires à transfuser pour obtenir une élévation de 0,5 à 1 g d’Hb chez le receveur ; (3) la production de plusieurs unités de globules rouges à partir d’un seul sang de cordon réduirait les risques de contamination par des virus ou des agents non conventionnels (voir plus haut) ; (4) le sang de cordon est une source facilement disponible de CSH.

Ce travail propose donc une nouvelle technologie de production à grande échelle de cellules érythroïdes ayant un intérêt transfusionnel potentiel, dans la mesure où nous montrons pour la première fois que des précurseurs érythroïdes produits ex vivo en grande quantité conservent leur capacité de terminer leur maturation in vivo jusqu’au stade de globules rouges mûrs contenant de l’hémoglobine adulte fonctionnelle.

Si ces résultats sont confirmés chez l’homme, c’est-à-dire si ces précurseursérythroïdes nucléés ne sont pas détruits dans la rate ou dans le foie des receveurs, on pourra alors envisager la constitution de banques de sang de cordon pour la production de globules rouges de phénotypes particuliers. Il existe en effet en médecine transfusionnelle des situations d’impasse dues à la non-disponibilité d’unités érythrocytaires compatibles.

L’intérêt potentiel de la transfusion de précurseurs érythroblastiques se situe à plusieurs niveaux.

• Sur le plan de l’efficacité transfusionnelle, l’injection de cellules qui donneront naissance en quelques jours à une population de globules rouges homogènes en âge peut améliorer significativement le rythme transfusionnel et diminuer à terme la surcharge martiale des polytransfusés en réduisant le nombre de transfusions.
• Sur le plan de la sécurité transfusionnelle, le sang placentaire est à l’évidence privilégié car c’est le moins susceptible aux contaminations virales ou aux agents non conventionnels, comparé aux produits transfusionnels actuellement disponibles.
• Sur le plan des indications transfusion-nelles, on peut raisonnablement envisager la constitution de banques de sang placentaire de phénotypes rares.
• Sur le plan de la prospective, cette phase est un préalable indispensable à un développement futur à partir de cellules souches périphériques pour des applications autologues.

Il ne s’agit pas ici de proposer une alternative à la transfusion classique, mais une approche complémentaire dont il importe maintenant d’évaluer la faisabilité et l’intérêt transfusionnel pour des débouchés thérapeutiques ultérieurs potentiellement considérables.