En dépit d’avancées significatives, nos connaissances sur la physiopathologie des cancers sont encore parcellaires et les retombées pratiques de ces recherches dans le domaine du dépistage, du diagnostic, du pronostic ou des traitements sont encore trop limitées. La compréhension des différentes étapes permettant le passage d’une lésion localisée vers une tumeur invasive est particulièrement importante car elle conditionne la prévention et la prise en charge des cancers invasifs dont la mortalité reste élevée (Figure 1). C’est pourquoi, il est nécessaire d’élaborer de nouvelles stratégies pour identifier les protéines impliquées dans des mécanismes physiologiques ou pathologiques en ligne directe avec l’initiation et/ou la progression tumorale. Ces approches se focalisent non plus sur l’identification d’un marqueur unique, mais sur plusieurs marqueurs co-exprimés, débouchant ainsi sur l’établissement d’un profil d’expression ou d’une carte d’identité pour chaque tumeur. Une telle signature moléculaire associée aux données cliniques et anatomopathologiques devrait permettre le dépistage des stades précoces de cancer avant -l’apparition des signes cliniques. Récemment, les progrès en nanotechnologies fondés sur des méthodes de chromatographie liquide ou de surface ont permis l’émergence de nouvelles techniques d’analyse protéomique appliquées aux pathologies humaines [ 1– 6]. Dans cet article, nous ne détaillerons pas l’ensemble de ces technologies. En revanche, nous nous focaliserons sur une plate-forme qui associe la chromatographie d’affinité de surface (ProteinChip®) et la spectrométrie de masse et qui nous semble, à ce jour, la mieux adaptée aux contraintes liées à la protéomique clinique.

Figure 1. Diagramme de la progression tumorale. Il est généralement admis que l’oncogenèse suit un schéma progressif au cours duquel s’accumulent des altérations morphologiques et moléculaires aboutissant à un dérèglement du comportement de la cellule avec des processus de prolifération et d’invasion (franchissement de la membrane basale, envahissement loco-régional, métastase). Par définition, les marqueurs tumoraux sont les indicateurs biologiques de ces changements moléculaires survenant lors du processus tumoral. Ils sont généralement le reflet d’altérations génétiques comme des mutations, des pertes d’hétérozygotie ou des remaniements chromosomiques qui, au final, vont affecter un certain nombre de gènes actifs et leurs produits. La caractérisation moléculaire et fonctionnelle de l’ensemble de ces altérations et de leurs effets permet d’envisager l’établissement d’une signature moléculaire des tumeurs à un stade précis du processus tumoral. En théorie, ces marqueurs peuvent apporter des éléments d’information importants pour le dépistage d’un cancer pendant la phase asymptomatique, pour son diagnostic et son pronostic, mais aussi pour la surveillance thérapeutique à un stade plus avancé de la maladie.

Figure 1. Diagramme de la progression tumorale. Il est généralement admis que l’oncogenèse suit un schéma progressif au cours duquel s’accumulent des altérations morphologiques et moléculaires aboutissant à un dérèglement du comportement de la cellule avec des processus de prolifération et d’invasion (franchissement de la membrane basale, envahissement loco-régional, métastase). Par définition, les marqueurs tumoraux sont les indicateurs biologiques de ces changements moléculaires survenant lors du processus tumoral. Ils sont généralement le reflet d’altérations génétiques comme des mutations, des pertes d’hétérozygotie ou des remaniements chromosomiques qui, au final, vont affecter un certain nombre de gènes actifs et leurs produits. La caractérisation moléculaire et fonctionnelle de l’ensemble de ces altérations et de leurs effets permet d’envisager l’établissement d’une signature moléculaire des tumeurs à un stade précis du processus tumoral. En théorie, ces marqueurs peuvent apporter des éléments d’information importants pour le dépistage d’un cancer pendant la phase asymptomatique, pour son diagnostic et son pronostic, mais aussi pour la surveillance thérapeutique à un stade plus avancé de la maladie.

Par définition, les marqueurs tumoraux ne sont pas statiques et leur expression varie au cours du temps en fonction de l’état général du patient, du processus tumoral ou des traitements (Figure 1). En pratique, bien qu’un grand nombre de marqueurs présomptifs ait été identifié, peu d’entre eux ont été promus et recommandés pour une utilisation diagnostique dans la population générale (Tableau I). Leur utilisation est actuellement limitée le plus souvent à l’établissement du bilan initial du cancer (valeur de référence), à l’évaluation de l’efficacité thérapeutique et à la surveillance d’une récidive. La performance d’un test diagnostic est fondée sur sa capacité à classer correctement les individus dans les différents sous-groupes cliniques (sujets sains versus sujets malades). Le test idéal devrait être totalement négatif chez les sujets en bonne santé (l00 % de spécificité) et totalement positif pour un type de tumeur donnée (100 % de sensibilité). Par ailleurs, ces marqueurs devraient montrer une corrélation nette entre leur concentration sérique et la taille de la tumeur. Actuellement, il existe peu de marqueurs possédant une spécificité et une sensibilité suffisantes pour avoir une utilité en clinique dans le diagnostic des stades précoces des cancers. Seuls l’antigène prostatique spécifique (PSA) et la thyrocalcitonine sont utilisés en routine, respectivement pour le dépistage et le diagnostic des cancers de la prostate et des formes familiales de cancers médullaires de la thyroïde. Ces deux seuls exemples illustrent la difficulté d’identifier des marqueurs de lésions cancéreuses pré-invasives qui sont, par définition, des tumeurs très localisées ne franchissant pas la membrane basale. Ces marqueurs correspondent généralement à des protéines sécrétées directement par les cellules cancéreuses ou par le microenvironnement tumoral dans un espace vasculaire de diffusion à proximité de la tumeur. Toute la difficulté consiste à les identifier et à les doser dans la circulation générale.

Tableau I. Marqueurs utilisés dans le dépistage (D), le diagnostic (Dg) et/ou la surveillance (S) de cancers.

Tableau I. Marqueurs utilisés dans le dépistage (D), le diagnostic (Dg) et/ou la surveillance (S) de cancers.

Récemment, des avancées méthodologiques en spectrométrie de masse ont ouvert des perspectives intéressantes pour l’identification de nouveaux marqueurs tumoraux. Parmi celles-ci, la plate-forme SELDI-TOF (surfaced-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight) présente de nombreux avantages par rapport aux autres techniques, notamment en raison de sa simplicité d’utilisation, de sa sensibilité et de sa capacité d’analyse à haut débit des échantillons (près de 800/jour). Cette technique permet la séparation, la détection et l’analyse de protéines, directement à partir de l’échantillon biologique avec une sensibilité de l’ordre de la femtomole (Figure 2). Elle est toutefois limitée par la gamme de masse protéique analysable, avec une très bonne détection pour les protéines inférieures à 20-30 kDa et une sensibilité moindre pour les protéines de plus hautes masses. En combinant les différentes surfaces chromatographiques disponibles, on obtient une vue d’ensemble des peptides et des protéines présents dans un échantillon donné. L’analyse différentielle et statistique de l’ensemble des données fournies par les profils protéiques des groupes témoins (sujets sains sans cancer) et pathologiques est une des étapes les plus importantes de ces études protéomiques. Pour cela, il existe une multitude d’algorithmes informatiques fondés sur des analyses statistiques multivariées (analyse discriminante, classification hiérarchique…). Ces algorithmes permettent d’analyser des données complexes et d’extraire des spectres de masse la meilleure combinaison de marqueurs capables de discriminer chacun des deux groupes. Par la suite, l’identification des marqueurs potentiels nécessite des étapes supplémentaires de purification par des méthodes électrophorétiques ou chromatographiques avant de caractériser précisément la protéine d’intérêt par spectrométrie de masse.

Figure 2. Principe de la technologie SELDI-TOF (surface-enhanced laser desorption and ionization time-of-flight). Cette plate-forme combine la chromatographie de surface à la spectrométrie de masse. En pratique, quelques microgrammes de protéines issues d’échantillons variés (liquides biologiques, cellules ou tissus) sont directement adsorbés sur une surface de 2 mm2 présentant des propriétés chromatographiques variées. En fonction de la surface chromatographique choisie, le mélange protéique subit un fractionnement qui dépend des propriétés chimiques (anionique, cationique, hydrophobique, hydrophilique, affinité aux métaux) ou biologiques des protéines (liaison à un anticorps, un peptide, un récepteur, un ligand ou un acide nucléique). Après une série d’étapes de lavage, les protéines retenues sont recouvertes d’une matrice qui va absorber l’excès d’énergie lors de l’ionisation de l’échantillon par désorption au laser et permettre l’analyse en spectrométrie de masse en temps de vol (la spectrométrie de masse en temps de vol consiste à accélérer tous les ions à la même énergie cinétique. Leurs vitesses étant inversement proportionnelles à la racine carrée de leurs masses, les ions plus légers arrivent au détecteur plus rapidement que les ions plus lourds, ce qui permet de les séparer). Au final, on obtient un profil protéique représentant les différentes protéines en fonction du rapport masse sur charge (M/Z). Ces profils sont ensuite normalisés et calibrés puis analysés de manière différentielle par des algorithmes informatiques variés afin d’établir un profil protéique spécifique.

Figure 2. Principe de la technologie SELDI-TOF (surface-enhanced laser desorption and ionization time-of-flight). Cette plate-forme combine la chromatographie de surface à la spectrométrie de masse. En pratique, quelques microgrammes de protéines issues d’échantillons variés (liquides biologiques, cellules ou tissus) sont directement adsorbés sur une surface de 2 mm2 présentant des propriétés chromatographiques variées. En fonction de la surface chromatographique choisie, le mélange protéique subit un fractionnement qui dépend des propriétés chimiques (anionique, cationique, hydrophobique, hydrophilique, affinité aux métaux) ou biologiques des protéines (liaison à un anticorps, un peptide, un récepteur, un ligand ou un acide nucléique). Après une série d’étapes de lavage, les protéines retenues sont recouvertes d’une matrice qui va absorber l’excès d’énergie lors de l’ionisation de l’échantillon par désorption au laser et permettre l’analyse en spectrométrie de masse en temps de vol (la spectrométrie de masse en temps de vol consiste à accélérer tous les ions à la même énergie cinétique. Leurs vitesses étant inversement proportionnelles à la racine carrée de leurs masses, les ions plus légers arrivent au détecteur plus rapidement que les ions plus lourds, ce qui permet de les séparer). Au final, on obtient un profil protéique représentant les différentes protéines en fonction du rapport masse sur charge (M/Z). Ces profils sont ensuite normalisés et calibrés puis analysés de manière différentielle par des algorithmes informatiques variés afin d’établir un profil protéique spécifique.

Les données présentées dans cet article illustrent l’intérêt du concept de signature moléculaire tumorale comme nouvel outil de diagnostic des cancers. Même si des progrès restent à faire, ces résultats laissent présager de nombreux développements de la protéomique clinique en pathologie cancéreuse. Ainsi, les tests biologiques du futur pourraient permettre de détecter des lésions pré-cancéreuses dans la population générale à partir d’une combinaison de marqueurs déterminés. De tels développements pourraient avoir un impact très important en clinique, notamment en améliorant le diagnostic précoce des cancers et en permettant de mieux caractériser des groupes à risques évolutifs pour leur proposer des thérapeutiques préventives adaptées.