Le couplage excitation-contraction (CEC) est un mécanisme fondamental, caractéristique des cellules contractiles musculaires squelettiques et cardiaques. Il désigne l’ensemble des processus qui assurent la transformation du stimulus électrique (potentiel d’action, PA) en un signal intracellulaire permettant d’activer la contraction des myocytes. La dépolarisation membranaire conduit à l’ouverture des canaux calciques de type L (aussi appelés récepteurs des dihydropyridines, DHPR) situés essentiellement sur des invaginations membranaires appelées tubules transverses. L’entrée de Ca²⁺ qui en résulte est insuffisante pour déclencher la contraction. Elle est cependant suffisante pour activer l’ouverture du canal calcique du réticulum sarcoplasmique (RS), aussi appelé récepteur de la ryanodine, RyR, selon un mécanisme autocatalytique appelé CICR (Ca²⁺-induced Ca²⁺-release). Ainsi, la concentration en Ca²⁺ ([Ca²⁺]) cytoplasmique passe localement d’une valeur de repos de ~100 nM à 1 µM, suffisante pour activer les protéines contractiles et la contraction musculaire. Cette fonction cellulaire hautement spécialisée, qui permet de réguler les variations intracellulaires de la [Ca²⁺], repose sur une architecture membranaire, une compartimentation cellulaire et une organisation moléculaire parfaitement adaptées qui placent le RyR au centre du CEC en situation physiologique ou pathologique.

Trois isoformes de RyR (RyR1, RyR2, RyR3) ont été identifiées et leurs gènes clonés. Elles sont codées par 3 gènes différents et présentent 70 % d’homologies entre elles [ 1]. Seule la protéine RyR2 est exprimée dans le cœur. C’est un récepteur homotétramérique (565 kDa par sous-unité). L’association quadrangulaire des sous-unités dessine un pore central permettant la diffusion des ions Ca²⁺. La structure tridimensionnelle complète de cette macromolécule n’est pas encore connue. On sait cependant que chaque sous-unité est formée d’une partie transmembranaire carboxy-terminale formant le pore du canal et d’une large partie cytoplasmique amino-terminale appelée « pied », impliquée dans la régulation de l’activité du RyR2 par une interaction de type protéine-protéine (Figure 1) [ 2]. Chacune des sous unités est associée à des protéines régulatrices pour former un complexe macromoléculaire. L’intégrité de leur interaction avec les sous unités du RyR2 joue un rôle déterminant au cours de pathologies cardiaques. Les principales protéines régulatrices caractérisées à ce jour sont décrites ci-dessous.

Figure 1. Représentation schématique du complexe macromoléculaire formé par le récepteur de la ryanodine et ses protéines associées. CaM : calmoduline ; CSQ : calsequestrine ; FKBP : calstabine 2.

Figure 1. Représentation schématique du complexe macromoléculaire formé par le récepteur de la ryanodine et ses protéines associées. CaM : calmoduline ; CSQ : calsequestrine ; FKBP : calstabine 2.

• La calstabine 2 (FKBP12.6) est une enzyme à activité peptidyl-propyl-cis-trans-isomérase de 12,6 kDa qui se fixe sur chaque monomère de RyR2 avec une forte affinité et une stœchiométrie de 1:1. Les mesures électrophysiologiques de l’activité des RyR2 montrent que l’interaction de la calstabine 2 avec le RyR2 stabilise l’état fermé du canal ; sa dissociation augmente la probabilité d’ouverture (Po) et induit des états de sous-conductance [ 3]. La calstabine 2 est certainement la protéine régulatrice qui a suscité à ce jour le plus grand intérêt sur le plan mécanistique, en raison de son rôle important en physiopathologie.
• La calmoduline est une protéine ubiquitaire de 17 kDa à haute affinité pour le Ca²⁺, qui peut se fixer avec une stœchiométrie de 1:1 sur chaque monomère de RyR2. Elle exerce une action inhibitrice sur RyR2 quelle que soit la [Ca²⁺] [ 4]. Par ailleurs, l’interaction RyR2/calmoduline dépend fortement de l’état Redox des milieux. Une déficience en calmoduline conduit, chez la souris, à une hypertrophie myocardique et à une mort prématurée [ 5]. Une telle dysfonction n’a cependant pas encore été observée chez l’homme.
• Le RyR2 est également associé à la protéine kinase A (PKA) et la Ca²⁺/calmoduline Kinase II (CamKII). La stimulation β-adrénergique entraîne la phosphorylation du RyR2 par la PKA sur la sérine 2808, ce qui conduit à la dissociation transitoire de la calstabine 2 et à l’activation du canal. C’est un effet adaptatif bénéfique, en réponse à un stress, qui permet une meilleure performance du CEC. Cependant, une hyperphosphorylation chronique du RyR2 par la PKA a un effet délétère qui maintient le canal dans un état de sous-conductance permanent. La PKA est liée au RyR2 par la protéine d’ancrage mAKAP qui assure également une interaction étroite avec la phosphodiestérase de type 4D3 (PDE4D3) [ 6]. Les phosphatases de type 1 et 2A (PP2A) sont également situées à proximité. Elles sont liées au RyR2 par leurs protéines d’ancrage respectives, la spinophiline et la PR130. Les phosphatases et les phosphodiestérases permettent, respectivement, de déphosphoryler le canal et de réduire localement la concentration en AMPc.

Le RyR2 peut également être phosphorylé sur la sérine 2815 par la CamKII. Cette phosphorylation, qui n’est pas associée à une dissociation de calstabine 2, augmente la Po du RyR2 [ 7], de manière plus modérée que la phosphorylation PKA-dépendante [ 8]. Elle semble jouer un rôle important dans la régulation du CEC cardiaque lors de changements du rythme et serait impliquée dans le contrôle de la relation force-fréquence [8]. Certains auteurs lui accordent cependant un rôle possible au cours de l’insuffisance cardiaque

• La sorcine est une protéine cytosolique de 22 kDa, à haute affinité pour le Ca²⁺, qui se lie également au RyR2. Elle exerce une action inhibitrice sur le RyR2. Cet effet est réduit lorsque la sorcine est phosphorylée par la PKA [ 9, 10].

Les protéines évoquées ci-dessus exercent leur action sur le RyR2 par une interaction sur la boucle cytoplasmique. On dénombre cependant d’importantes régulations qui s’opèrent via la face luminale ou face interne de la membrane du RS. Cette régulation fait, en particulier, intervenir des protéines à fort pourvoir chélateur du Ca²⁺ telles que la calséquestrine ou les HRC (histidine rich Ca²⁺-binding protein) qui permettent de maintenir une forte [Ca²⁺] dans le RS sous forme liée et sous forme libre (~1 mM). La calséquestrine interagit directement avec le RyR2 et module son activité. Par ailleurs, une réduction importante de la [Ca²⁺] du RS conduit à la fermeture des RyR2 et à une période réfractaire qui se maintient jusqu’à la reconstitution des stocks calciques du RS par la Ca²⁺ ATPase du RS (SERCA) [ 11]. On recense enfin d’autres protéines transmembranaires interagissant avec le RyR2 telles que la triadine, la junctine, la junctate et les junctophilines qui semblent aussi moduler son activité. Le rôle précis de chacune de ces molécules reste à explorer et cette liste est, par ailleurs, certainement loin d’être exhaustive.

Le RyR2, du fait de sa structure macromoléculaire complexe, présente différents niveaux de régulation de l’activité du canal (Tableau I), avec un rôle prépondérant des phosphorylations contrôlées de façon directe par l’activité des kinases (PKA et CamKII), et des phosphatases et phosphodiestérases. Cependant ces RyR2 sont également régulés par différentes « petites molécules » et facteurs régulateurs non protéiques essentiels.

Tableau I. Liste des principales protéines régulatrices associées au récepteur de la ryanodine et formant le complexe macromoléculaire.

Tableau I. Liste des principales protéines régulatrices associées au récepteur de la ryanodine et formant le complexe macromoléculaire.

Le récepteur de la ryanodine doit son nom à cet alcaloïde végétal qu’il fixe avec une très grande spécificité. La ryanodine se fixe sur deux sites de haute et de faible affinité situés sur l’extrémité carboxy-terminale [ 16] ; à faible concentration (~10 nM), elle maintient le canal dans un état de sous-conductance qui conduit à une fuite de Ca²⁺ et à la vidange du RS. A forte concentration (>1 µm), le canal est maintenu dans un état fermé. Le rouge de ruthénium est également un bloqueur puissant des RyR2, mais il est plus rarement utilisé en raison de sa faible spécificité pour les RyR2.

La caféine est un autre alcaloïde végétal très employé pour l’analyse fonctionnelle du RyR2 et du niveau de charge calcique du RS. Cet agent, en se fixant sur le RyR2, augmente la Po du canal, les temps moyens d’ouverture et induit une libération importante et transitoire de Ca²⁺ qui conduit à une vidange rapide du RS.

Les RyR2 sont très sensibles aux anesthésiques couramment utilisés en clinique. Les composés volatiles comme l’halothane ou l’isoflurane exercent un effet agoniste sur le canal. Les anesthésiques locaux (tétracaïne, procaïne, bupivacaïne) sont agonistes ou antagonistes selon la molécule utilisée.

Des efforts importants ont récemment porté sur la mise au point d’un dérivé benzothiazépine plus communément appelé JTV-519. L’analyse des effets de cette molécule indique qu’elle stabilise l’état fermé des RyR2 en diastole via une meilleure fixation de la calstabine 2 ; ce qui résulte, sur le plan fonctionnel, en une diminution de la fuite spontanée de Ca²⁺ du RS [ 17]. Par cette action sur le RyR2, cette molécule améliorerait la fonction systolique et présenterait un potentiel anti-arythmique important [17, 18].

La mise en évidence du site d’interaction du JTV-519 sur la séquence des RyR2 a récemment permis de proposer un modèle moléculaire du mode d’action de cette drogue [ 36].

L’entrée de Ca²⁺ au cours du PA déclenche l’ouverture des RyR2 et la libération du Ca²⁺ du RS : c’est le Ca²⁺-induced Ca²⁺-release (CICR). L’ouverture d’un seul DHPR est suffisante pour déclencher une libération élémentaire de Ca²⁺ (Ca²⁺ -spark) générée par un petit groupe de RyR2. La sommation de milliers de sparks associés au courant calcique de type L (I_Ca,L) permet une augmentation massive et transitoire du Ca²⁺ cytosolique déclenchant la contraction. L’amplitude de ces variations transitoires de [Ca²⁺]_i est proportionnelle à I_Ca,L et à la charge du RS. La libération de Ca²⁺ du RS décrit une courbe en cloche en fonction de la concentration Ca²⁺. En effet, le RyR2 s’active pour des concentrations de Ca²⁺ <100 nM, et atteint un maximum à plus de 10 µM. La Po du canal devient très faible pour des concentrations de l’ordre du mM, et le canal s’inactive.

En plus de leur rôle essentiel pour la contraction cardiaque, les RyR2 modulent constamment le niveau de Ca²⁺ cytosolique (systolique et diastolique) qui est un facteur de régulation important de différents canaux et transporteurs ioniques membranaires. On peut citer le canal calcique de type L, les canaux chlorure activés par le Ca²⁺, le canal potassique à rectification entrante (I_K1) et l’échangeur Na⁺/Ca²⁺. Via ces effets, le RyR2 devient un acteur majeur de la régulation du rythme cardiaque.

Au vu des rôles majeurs joués par le RyR2 dans le fonctionnement normal des cellules cardiaques via différents modes de régulation et de la complexité de sa structure, il apparaît intuitivement qu’une dysfonction du RyR2 ou de l’une de ses protéines partenaires a des conséquences fonctionnelles importantes. La littérature abonde dans ce sens. Des dysfonctionnements des RyR2 sont associés à des troubles du CEC et de l’activité électrique. Récemment, on a découvert que certains dysfonctionnements liés à des mutations naturelles du RyR2 sont liés à des troubles du rythme sévères qui peuvent conduire à une mort subite ; c’est le cas, par exemple, des tachycardies ventriculaires polymorphes catécholaminergiques (TVPC) [ 19, 20]. Mais certaines pathologies acquises, comme l’insuffisance cardiaque, induisent également un dysfonctionnement des RyR2 qui semble impliquer des interactions protéine-protéine, comme dans le cas de la calstabine 2.

Les tachycardies ventriculaires polymorphes catécholaminergiques(TVPC) liées à des mutations des RyR2 représentent un trouble du rythme assez rare qui, contrairement aux syndromes du QT long, n’est pas observé chez le nourrisson [ 35]. Les TVCP se révèlent plus tardivement, typiquement lors de l’effort ou du stress et en l’absence de toute altération morphologique ou structurale du myocarde, avec un risque élevé de mort subite fatale chez l’adolescent(e) et le(a) jeune adulte. Les tachycardies ventriculaires associées à un QT long reflètent une anomalie d’un canal ionique (Na⁺, K⁺, Ca²⁺) qui entraîne une repolarisation anormale du potentiel d’action [ 21, 35]. Les TVPC sont liées principalement à une dérégulation des mouvements calciques intracellulaires, en particulier du fait d’une augmentation spontanée de l’activité des RyR2 générant une fuite de calcium y compris pendant la diastole. Le Ca²⁺ libéré de manière intempestive a pour conséquence de moduler l’activité de canaux ioniques Ca²⁺-dépendants qui deviennent alors sources d’arythmies. Ces effets sont exacerbés lors d’une stimulation β-adrénergique, principalement en stimulant le niveau de charge du réticulum sarcoplasmique et, donc, en augmentant la libération calcique via les RyR2 [ 22].

C’est au cours des années 2000 que le lien entre ces arythmies malignes, responsables de mort subite, et des mutations du gène codant pour le RyR2 (chromosome 1q42.1-43) a été découvert [19, 20]. À ce jour, 69 mutations ont été identifiées et recensées dans une revue très récente [19, 20]. Les mutations ont été identifiées au niveau de quatre régions du gène codant pour RyR2 : CPVT-I (77-466), CPVT-II (2246-2534), CPVT-III (3778-4201) et CPVT-IV (4497-4959) et semblent impliquer une altération des interactions entre domaines au sein du RyR2, des perturbations du complexe macromoléculaire et une modification de la sensibilité au Ca²⁺ cytoplasmique. Curieusement, aucune mutation au niveau du pore, essentiel à la perméation, et au niveau de la partie carboxy-terminale extrême du RyR2 impliquée dans la stabilité du canal, n’ont été rapportées [19, 20].

Sur le plan fonctionnel, plusieurs mécanismes résultant de ces mutations ont été évoqués comme une augmentation de l’affinité du canal pour le Ca²⁺ sur la face luminale du RS ou cytoplasmique, ou encore une dissociation de la protéine régulatrice FKBP12.6. Ces mutations sont responsables d’une activité anormale du canal et d’une altération de l’homéostasie calcique diastolique qui semble conduire essentiellement à des post-dépolarisations tardives au cours de stress catécholaminergiques. Les β-bloqueurs, bien que d’une efficacité aléatoire et relative, restent à ce jour un traitement couramment utilisé. Dans les situations où une dissociation de la protéine partenaire FKBP12.6 interviendrait, un traitement par le JTV-519, ou par l’un de ses analogues fonctionnels, semble une approche thérapeutique à considérer [ 23].

Des TVCP ont également été associées à des mutations portées par la calséquestrine qui peuvent conduire à des anomalies de fonctionnement des RyR2 par un mécanisme qui reste à déterminer [ 24].

Au cours de l’IC, l’homéostasie calcique est profondément altérée avec une diminution de la charge du RS et des variations transitoires de [Ca²⁺]_i (diminution du calcium systolique). Ces modifications sont associées à une augmentation de [Ca²⁺]_i au cours de la diastole. Ces détériorations ont été attribuées à un défaut de recaptage du Ca²⁺ vers le RS par la pompe SERCA ainsi qu’à un dysfonctionnement des RyR2. Il a ainsi été proposé qu’au cours de l’IC, la stimulation β-adrénergique chronique est à l’origine d’une hyperphosphorylation du canal conduisant à la dissociation de la calstabine 2 des RyR2 qui provoque : (1) en systole, la désynchronisation des ouvertures et fermetures du canal, avec un ralentissement des cinétiques ainsi qu’à la diminution de l’amplitude du signal calcique transitoire [ 25], et (2) en diastole à une augmentation de la fuite du Ca²⁺, contribuant ainsi à la diminution de la charge en Ca²⁺ du RS [ 26].

Les β-bloqueurs favoriseraient la stabilité du complexe calstabine 2 / RyR2 et normaliseraient l’activité du canal [ 27]. Cependant, au cours de l’IC, la stimulation sympathique chronique tend à faire diminuer la densité des récepteurs β-adrénergiques et plus particulièrement l’isoforme β₁. L’analyse du complexe macromoléculaire au cours de l’IC démontre que cette contradiction résulte de la perte du complexe canalaire des phosphatases et de la PDE4D3 [ 28].

L’importance de l’interaction RyR2-calstabine 2 dans les processus physiopathologiques semble plutôt admise à ce jour. Cependant, le concept de la dissociation de la calstabine 2 induite par la phosphorylation du RyR2 sur la sérine 2808 au cours de l’IC est très controversé. L’utilisation récente d’une souris transgénique pour un récepteur RyR2 dans lequel la sérine 2808, phosphorylable par la PKA, a été substituée par une alanine non phosphorylable, semble indiquer une régulation β-adrénergique normale et exclure le rôle de la phosphorylation du RyR2 sur la sérine 2808 dans le développement de l’insuffisance cardiaque [ 29].

Ainsi, certains auteurs privilégient un dysfonctionnement des RyR2 médiée par la CamKII plutôt que par la PKA. Cela reste encore très largement débattu. Cependant, l’exploration physiopathologique du rôle d’EPAC (exchange protein directly activated by cAMP), voie nouvellement caractérisée dans la régulation des RyR2 [ 30, 31], permettra peut être de mieux appréhender les divergences des résultats observés.

De nombreux décès de patients porteurs d’une cardiopathie ischémique ou d’une hypertrophie cardiaque, comme chez ceux atteints de TVCP, sont dus à des troubles du rythme ventriculaires (résultant de tachycardies ventriculaires, de fibrillations ventriculaires et de blocs auriculo-ventriculaire). Au niveau cellulaire, les post-dépolarisations tardives (DAD, delayed after depolarisation) ou précoces (EAD, early after depolarisation) sont les deux troubles majeurs de la repolarisation. Ils sont généralement associés à des modifications abruptes de la fréquence cardiaque. Les EAD (fibrillation ventriculaire) apparaissent essentiellement au cours d’une bradycardie alors que les DAD sont associées à une augmentation de la fréquence cardiaque [ 32]. Comme cela est décrit précédemment, le rôle central des RyR2 au cours de changements de la fréquence cardiaque en fait un acteur essentiel des troubles du rythme et de la mort subite, en particulier pendant la phase diastolique au cours de laquelle la fuite calcique peut déclencher des DAD.

La fréquence cardiaque est régulée par la stimulation β-adrénergique. Elle augmente le recaptage du Ca²⁺ dans le RS et, donc, augmente la fuite spontanée via les RyR2. Cette régulation physiologique normale peut s’avérer délétère chez des sujets dont les RyR2 présentent une dysfonction acquise ou chronique, et amplifier cette dysfonction jusqu’à l’établissement de troubles du rythme graves. En effet, l’augmentation de la [Ca²⁺]_i qui en résulte augmente l’activité de l’échangeur Na⁺/Ca²⁺ au cours de la diastole favorisant ainsi la dépolarisation cellulaire. Nous avons récemment démontré que la fuite de Ca²⁺ diastolique, générée par les RyR2, avait pour conséquence de bloquer le courant repolarisant I_K1 permettant à la cellule, en synergie avec l’échangeur Na⁺/Ca²⁺, de se dépolariser jusqu’au seuil de déclenchement d’un nouveau PA [ 33, 34]. La cellule entre alors dans un cycle auto-entretenu responsable de DAD [32] (Figure 2). Dans ce contexte, une approche pharmacologique ciblant spécifiquement le RyR2 en normalisant sa fonction peut s’avérer essentielle dans le traitement des troubles du rythme cardiaque diastoliques.

Figure 2. Importance de la [Ca2+]i de repos (c’est-à-dire diastolique) sur le contrôle du potentiel membranaire de cardiomyocytes ventriculaires. En situation normale (A), l’activité des RyR2 est insignifiante et la faible quantité de Ca2+ libérée pendant la diastole est rapidement repompée par le RS. Le potentiel de repos diastolique est essentiellement contrôlé et maintenu à une valeur de l’ordre de -80 mV par l’activité des canaux potassiques à rectification entrante (IK1). En cas d’anomalie de fonctionnement des RyR2 (B), on observe une fuite de calcium du RS pendant la diastole et une surchage cytosolique qui active le courant entrant dépolarisant de l’échangeur Na+/Ca2+ et inhibe le courant IK1. Cela se traduit par des dépolarisations membranaires spontanées pouvant atteindre le seuil d’excitation des canaux sodiques, et le déclenchement d’un potentiel d’action précoce ; on parle alors de post-dépolarisation tardive (DAD).

Figure 2. Importance de la [Ca2+]i de repos (c’est-à-dire diastolique) sur le contrôle du potentiel membranaire de cardiomyocytes ventriculaires. En situation normale (A), l’activité des RyR2 est insignifiante et la faible quantité de Ca2+ libérée pendant la diastole est rapidement repompée par le RS. Le potentiel de repos diastolique est essentiellement contrôlé et maintenu à une valeur de l’ordre de -80 mV par l’activité des canaux potassiques à rectification entrante (IK1). En cas d’anomalie de fonctionnement des RyR2 (B), on observe une fuite de calcium du RS pendant la diastole et une surchage cytosolique qui active le courant entrant dépolarisant de l’échangeur Na+/Ca2+ et inhibe le courant IK1. Cela se traduit par des dépolarisations membranaires spontanées pouvant atteindre le seuil d’excitation des canaux sodiques, et le déclenchement d’un potentiel d’action précoce ; on parle alors de post-dépolarisation tardive (DAD).