Depuis près d’une vingtaine d’années, les maladies génétiques touchant différents organes ou tissus ont fait l’objet de recherches intenses dans l’espoir de les traiter par des approches de « correction génétique ». L’option la plus commune est l’introduction dans le génome de la cellule malade d’une ou de plusieurs copies saines du gène dont la mutation est à l’origine de la maladie, soit in vivo chez le patient, soit ex vivo dans les cellules en culture du patient. Les stratégies in vivo sont confrontées aux problèmes de l’accessibilité du tissu cible, de la spécificité et du rendement de la correction. Dans le cas de l’approche ex vivo, il faut, bien entendu, maîtriser la culture des cellules appropriées (provenant de l’organe ou du tissu ciblé) et pouvoir corriger fonctionnellement et à long terme leur défaut génétique tout en préservant les perspectives de réimplantation chez le patient.

L’épiderme, le tissu superficiel de la peau, occupe une place de premier plan dans le domaine de la thérapie génique [ 1– 7]. L’accessibilité du tissu cutané est un avantage évident. Certaines maladies génétiques cutanées (les génodermatoses), parfois extrêmement invalidantes et compromettant le pronostic vital des patients, ne bénéficient d’aucun traitement curatif efficace. Dans ces cas rares, dont la liste figure dans le Tableau 1, la correction génétique des cellules pourrait donc être une solution thérapeutique [ 8].

Tableau I. Exemples de génodermatoses qui pourraient bénéficier d’une thérapie génique cutanée.

Tableau I. Exemples de génodermatoses qui pourraient bénéficier d’une thérapie génique cutanée.

Dès 1975, Rheinwald et Green [ 9] établissent dans un travail pionnier les conditions de la culture des kératinocytes épidermiques sains à très long terme. Dans les conditions optimales, il est possible d’obtenir 1,5 m² d’épithélium en culture en deux à trois semaines, à partir d’une biopsie de peau saine de quelques cm². L’autogreffe des épithélium de culture ainsi obtenus a permis de sauver des milliers de personnes très gravement brûlées [ 10– 12]. En 1987, les équipes de Richard Mulligan et de Howard Green avec Yann Barrandon réussirent la première modification génétique de kératinocytes épidermiques humains en culture par transfert du gène de l’hormone de croissance à l’aide de rétrovirus recombinants [ 13]. À cette époque, la plupart des gènes responsables des génodermatoses étaient inconnus, mais les grandes lignes du schéma stratégique de la thérapie génique cutanée étaient néanmoins tracées. Vingt années de recherches plus tard, le groupe de Michele DeLuca a récemment rapporté la première greffe d’un épithélium de culture génétiquement modifié chez un patient atteint d’épidermolyse bulleuse jonctionnelle, une maladie due à la mutation d’un composant de la membrane basale (la laminine 5), support de l’épiderme [ 14, 38]. Si ce résultat concrétise l’aboutissement longtemps espéré de nombreux travaux expérimentaux antérieurs, et que le principe général de la thérapie génique cutanée ex vivo semble aujourd’hui acquis, certains aspects de la stratégie devront être adaptés à la nature de la pathologie ciblée, et, parmi ceux-ci, la nécessité ou non de sélectionner les cellules génétiquement corrigées. En effet, dans le cas des génodermatoses associées à une prédisposition aux cancers de la peau, en particulier le xeroderma pigmentosum ou certaines épidermolyses bulleuses (jonctionnelles ou dystrophiques), la sélection des cellules génétiquement corrigées est une exigence supplémentaire afin de limiter la possibilité de réimplanter chez le patient des cellules susceptibles d’initier une tumeur dans le greffon. À cet égard, une étude très récente de notre équipe CNRS à l’Institut Gustave Roussy, « Génétique et physiopathologie des cancers épidermiques », montre qu’il est maintenant possible de sélectionner très efficacement et sans altération des potentiels de croissance et de différenciation, une population kératinocytaire genétiquement manipulée et contenant une très forte proportion de cellules souches [ 15].

L’épiderme est un tissu stratifié dans lequel deux compartiments peuvent être distingués. La couche basale représente le compartiment prolifératif et contient une petite proportion de cellules souches (environ 1 %) [ 16, 17]. Une cellule souche est une cellule capable d’assurer le renouvellement d’un organe ou d’un tissu au cours de la vie d’un individu [ 18]. Dans l’épiderme interfolliculaire, la localisation des cellules souches n’est pas clairement déterminée. Il faut donc distinguer les cellules souches interfolliculaires des cellules souches folliculaires qui, chez les rongeurs, occupent une localisation bien déterminée dans la partie supérieure du feuillet externe du follicule pileux appelée « bulge » (renflement en français) [16, 19, 20] ; bien que le « bulge » ne soit pas détecté dans le follicule pileux humain, les cellules souches folliculaires y sont également concentrées dans une zone circonscrite du feuillet épithélial externe [ 21]. Les couches suprabasales de l’épiderme sont formées de cellules qui ne se divisent plus et sont engagées dans un processus séquentiel et irréversible de différenciation. Le renouvellement permanent de l’épiderme et sa capacité régénérative en cas de blessure limitée attestent de la présence de cellules souches. L’équilibre entre prolifération dans la couche basale et différenciation dans les couches cellulaires suprabasales témoigne de l’homéostasie épidermique [ 22]. Cet équilibre est perdu dans les pathologies non cancéreuses comme le psoriasis, ainsi que dans les carcinomes cutanés.

Le schéma général de la thérapie génique cutanée ex vivo est présenté sur la Figure 1. Comme dans le cas des grands brûlés, il faut pouvoir répondre à plusieurs contraintes : (1) obtenir une culture de grande qualité, c’est-à-dire contenant des cellules souches en proportion suffisante pour y assurer l’introduction du gène approprié ; (2) assurer un très fort pourcentage de cellules corrigées fonctionnellement et la pérennité à long terme de la correction dans la descendance des cellules corrigées ; (3) valider l’efficacité de la correction chez l’animal, par exemple après régénération de peau à long terme à partir des cellules corrigées. Ainsi, des feuillets épithéliaux humains génétiquement manipulés et cultivés ex vivo peuvent être greffés en lieu et place de la peau endogène chez des souris immunodéficientes [ 23]. Après quelques semaines, l’épiderme humain est produit et il est possible d’étudier sa fonction à long terme in vivo ; (4) établir l’innocuité de la correction génétique, en excluant les problèmes de mutagenèse insertionnelle, de transactivation d’oncogènes et de rejet immunitaire potentiel des cellules corrigées [14]. L’accessibilité du greffon cutané permettrait cependant, en cas de nécessité, de le retirer beaucoup plus facilement que dans le cas d’une greffe de cellules hématopoïétiques génétiquement corrigées [ 24]. (5) Enfin, étape ultime à l’issue de ces vérifications, réaliser la greffe d’un épithélium de culture génétiquement corrigé chez le patient [14].

Figure 1. De la biopsie à l’autogreffe. À partir d’une biopsie de peau saine de quelques cm2, il est possible, dans des conditions optimisées, d’obtenir des cultures de kératinocytes primaires ex vivo (1), et de suivre les étapes indiquées (2-5) pour arriver jusqu’à l’autogreffe chez le patient (6). Mavilio et al. [14] ont pu démontrer la faisabilité de cette stratégie dans le cas d’un patient atteint d’une épidermolyse bulleuse jonctionnelle.

Figure 1. De la biopsie à l’autogreffe. À partir d’une biopsie de peau saine de quelques cm2, il est possible, dans des conditions optimisées, d’obtenir des cultures de kératinocytes primaires ex vivo (1), et de suivre les étapes indiquées (2-5) pour arriver jusqu’à l’autogreffe chez le patient (6). Mavilio et al. [14] ont pu démontrer la faisabilité de cette stratégie dans le cas d’un patient atteint d’une épidermolyse bulleuse jonctionnelle.

La présence de cellules souches, leur correction génétique et leur maintien sont les facteurs limitants de toute approche de thérapie génique cutanée, faute de quoi la pérennité de la correction génétique est compromise [ 25, 26].

Quelle que soit la pathologie, l’objectif le plus raisonnable est, en général, d’obtenir « le maximum » de cellules souches génétiquement corrigées, pour assurer une proportion élevée de cellules fonctionnelles génétiquement corrigées dans un épithélium de culture destiné à la greffe. Dans le cas des génodermatoses associées à une prédisposition au cancer de la peau, en particulier le xeroderma pigmentosum ou les épidermolyses bulleuses dystrophiques ou jonctionnelles [ 27], il faut de plus limiter la possibilité de réimplanter avec le greffon des cellules potentiellement pré- cancéreuses ou cancéreuses - qui n’auraient pas reçu le gène thérapeutique. Il est alors nécessaire de « sélectionner » les cellules génétiquement corrigées, par exemple en co-exprimant dans les mêmes cellules le gène thérapeutique et un gène dont le produit confère la résistance à un antibiotique [ 28]. La plupart des gènes de sélection proviennent de micro-organismes et leurs produits protéiques sont donc potentiellement immunogènes chez l’individu immunocompétent, excluant leur utilisation dans une perspective de greffe. C’est pourquoi l’essai rapporté par Mavilio et al. n’a été possible qu’en l’absence de transfert d’un gène de sélection mais, d’après les auteurs, « virtuellement » 100 % des cellules réimplantées chez le patient étaient corrigées [14, 38]. En revanche, dans la mesure ou l’epidermolyse bulleuse jonctionnelle peut être associée aux carcinomes cutanés, la sélection des cellules génétiquement corrigées sera nécessaire dans les cas où l’efficacité de la correction génétique est inférieure à 100 %.

Correction génétique ex vivo des kératinocytes épidermiques de xeroderma pigmentosum

Le xeroderma pigmentosum (XP) est une génodermatose très rare à transmission autosomique récessive, dont la caractéristique majeure est, précisement, une prédisposition extrême aux cancers de la peau. Dès le plus jeune âge, les patients atteints de XP présentent une forte intolérance au soleil, illustrée par d’importants coups de soleil à la moindre exposition. Les ultraviolets de la lumière solaire introduisent des lésions dans l’ADN. Chez les patients XP, le système de réparation de ces lésions par excision de nucléotide est inefficace [ 29, 30]. L’absence de réparation de ces lésions mutagènes peut être à l’origine du développement tumoral. Les enfants atteints de XP ne bénéficient d’aucun traitement réellement efficace, et la prise en charge n’inclut qu’une photoprotection et une surveillance dermatologique strictes, afin de limiter l’apparition des tumeurs. Comme dans le cas des épidermolyses bulleuses, l’absence de traitement efficace motive les approches de correction génétique ex vivo des kératinocytes épidermiques de patients XP [ 31, 32]. Dans ce cas, la forte prédisposition aux cancers cutanés d’origine kératinocytaire impose la sélection des cellules génétiquement corrigées susceptibles d’être réimplantées chez le patient. Une stratégie inédite de sélection des cellules corrigées a récemment été proposée par notre équipe. La Figure 2 illustre cette stratégie. Les cellules différenciées de l’épiderme, qui ont perdu tout potentiel prolifératif, expriment à leur surface une petite protéine appelée CD24 [ 33]. Aucune cellule de la couche basale n’exprime cette protéine, ce qui exclut son expression par les cellules souches. En culture, les cellules prolifératives sont issues de la couche basale. La stratégie a donc été de faire exprimer la protéine CD24 à la surface de ces cellules basales à l’aide d’un vecteur rétroviral. Grâce à cette petite « étiquette de surface », les cellules prolifératives (y compris les cellules souches) ayant été transduites avec succès et exprimant l’antigène CD24 peuvent être purifiées à l’aide d’un anticorps spécifique reconnaissant la petite protéine CD24. Si la culture contient également des cellules différenciées (qui expriment le CD24 naturellement), celles-ci seront également sélectionnées mais, compte tenu de leur état différencié, seront incapables de proliférer et seront donc éliminées au cours de la culture. Ainsi, si la petite étiquette CD24 est co-exprimée avec un gène d’intérêt, toutes les cellules purifiées sur le critère d’expression de CD24 exprimeront également le gène d’intérêt [ 34]. L’étude démontre que le schéma théorique de cette nouvelle stratégie de sélection est vérifié [15]. L’utilisation d’un gène traceur (green fluorescent protein, GFP) a permis de suivre l’évolution des kératinocytes épidermiques génétiquement modifiés. Le gène CD24 et le gène codant la GFP ont été insérés dans un vecteur rétroviral dérivé du virus leucémogène de Moloney. Après leur infection par ces rétrovirus, les kératinocytes génétiquement manipulés ont été sélectionnés par immunoaffinité. De cette façon nous avons obtenu des populations quasiment pures (99,9 %) de cellules fluorescentes. La stabilité de l’expression des gènes codant la GFP et le CD24 exogènes a été observée pendant plus d’une année en culture au cours de laquelle les analyses clonales ont indiqué que la technique permettait d’enrichir fortement la population en cellules souches génétiquement manipulées (Figure 3). Ces cellules ont conservé un caryotype normal ainsi que tous leurs potentiels : elles sont ainsi capables de former une peau normale en terme de différenciation et de prolifération en culture organotypique ex vivo et, également, de regénérer à long terme (22 semaines) une peau normale in vivo après greffe chez la souris immunodéficiente (nu/nu) (Figure 3).

Figure 2. A. Schéma théorique de la stratégie de sélection CD24. Les cellules cultivées (1) à partir d’une petite biopsie cutanée sont infectées par un rétrovirus (CD24 IRES GFP, 2) permettant d’exprimer le gène de complémentation génétique aux vertus thérapeutiques. Ici, le gène choisi code pour la protéine GFP, qui émet de la fluorescence. Les cellules génétiquement modifiées sont ensuite sélectionnées à l’aide d’un anticorps spécifique (3), puis propagées en culture (4). B. Tous les kératinocytes infectés par le rétrovirus CD24 IRES GFP puis sélectionnés pour l’expression du CD24, expriment à la fois la GFP et le CD24 exogène, comme indiqué.

Figure 2. A. Schéma théorique de la stratégie de sélection CD24. Les cellules cultivées (1) à partir d’une petite biopsie cutanée sont infectées par un rétrovirus (CD24 IRES GFP, 2) permettant d’exprimer le gène de complémentation génétique aux vertus thérapeutiques. Ici, le gène choisi code pour la protéine GFP, qui émet de la fluorescence. Les cellules génétiquement modifiées sont ensuite sélectionnées à l’aide d’un anticorps spécifique (3), puis propagées en culture (4). B. Tous les kératinocytes infectés par le rétrovirus CD24 IRES GFP puis sélectionnés pour l’expression du CD24, expriment à la fois la GFP et le CD24 exogène, comme indiqué.

Figure 3. Regénération à long terme d’une peau normale après greffe chez la souris immunodéficiente. A. Résultats de l’analyse clonale (analyse clonale) obtenue soit avant la transduction rétrovirale (cellules parentales), soit après transduction rétrovirale et tri cellulaire sur le critère « expression du CD24 » (cellules CD24 GFP). Quarante-cinq semaines après la sélection, il est clair que les cellules transduites par le vecteur CD24 GFP présentent un potentiel clonogénique supérieur et générent des clones de taille supérieure (semaine 45, cellules CD24 GFP) par comparaison avec les cellules parentales au même passage (semaine 45, cellules parentales). B. Les cultures organotypiques (cultures organotypiques) montrent que l’histologie est correcte (histologie) et que toutes les cellules épidermiques expriment le gène traceur codant la GFP (GFP). C. L’expression du gène traceur GFP persiste à long terme dans la peau qui est produite après greffe sur la souris athymique Nude (22 semaines après greffe). L’histologie (histologie) et la différenciation épidermique (kératine 10) sont normales.

Figure 3. Regénération à long terme d’une peau normale après greffe chez la souris immunodéficiente. A. Résultats de l’analyse clonale (analyse clonale) obtenue soit avant la transduction rétrovirale (cellules parentales), soit après transduction rétrovirale et tri cellulaire sur le critère « expression du CD24 » (cellules CD24 GFP). Quarante-cinq semaines après la sélection, il est clair que les cellules transduites par le vecteur CD24 GFP présentent un potentiel clonogénique supérieur et générent des clones de taille supérieure (semaine 45, cellules CD24 GFP) par comparaison avec les cellules parentales au même passage (semaine 45, cellules parentales). B. Les cultures organotypiques (cultures organotypiques) montrent que l’histologie est correcte (histologie) et que toutes les cellules épidermiques expriment le gène traceur codant la GFP (GFP). C. L’expression du gène traceur GFP persiste à long terme dans la peau qui est produite après greffe sur la souris athymique Nude (22 semaines après greffe). L’histologie (histologie) et la différenciation épidermique (kératine 10) sont normales.

Cette méthode de sélection respecte donc le cahier des charges de la thérapie génique cutanée ex vivo. L’enrichissement des populations sélectionnées en cellules souches interfolliculaires devrait aussi permettre de progresser dans leur caractérisation. En effet, en raison de leur « dispersion » dans la couche basale de l’épiderme interfolliculaire, celles-ci ont été beaucoup moins étudiées que les cellules souches folliculaires qui occupent une localisation précise dans le follicule pileux [20, 35].

Je remercie le Dr Françoise Bernerd pour ses encouragements et sa lecture critique. Emilie Warrick est doctorante dans le cadre d’un doctorat CIFRE L’ORÉAL/CNRS. La recherche a été soutenue par l’Association pour la Recherche sur le Cancer, la Fondation de l’Avenir, la Société Française de Dermatologie, l’Association Française contre les Myopathies. Ces associations sont vivement remerciées pour leur aide.