L’activation des kinases RAF est un des paramètres biochimiques les plus fréquemment altérés dans les tumeurs humaines [ 1]. Du fait de leur rôle oncogénique, les kinases de la famille RAF^1, ont d’emblée attiré l’attention des biologistes intéressés par la transduction du signal et la physiologie des cellules cancéreuses. Chez les mammifères, la famille des kinases RAF est constituée de trois membres : A-RAF, B-RAF et C-RAF (anciennement Raf-1) [1]. Ces trois isoformes sont codées par des gènes distincts mais présentent d’importantes homologies de séquence (Figure 1). Elles partagent une organisation commune avec un domaine carboxy-terminal qui porte l’activité sérine/thréonine kinase, alors que le domaine amino-terminal est régulateur et possède la particularité essentielle d’interagir avec les protéines RAS activées. Le domaine amino-terminal concentre l’essentiel des différences de séquence entre les kinases RAF.

Figure 1 Structure des kinases RAF. Les isoformes de RAF (A-RAF, B-RAF, C-RAF) partagent trois régions conservées (les conserved regions CR1, CR2 et CR3). Le CR1 consiste en un domaine d’interaction avec RAS (Ras binding domain, RBD) suivi par un domaine riche en Cys (cystein rich domain, CRD), le CR2 est une région riche en résidus sérine/thréonine, et le CR3 porte l’activité kinase. Globalement, les kinases RAF sont ainsi organisées en deux parties fonctionnelles : un domaine aminoterminal régulateur, incluant CR1 et CR2, et un domaine carboxy-terminal catalytique. La présence d’une extension amino-terminale constitue la principale différence entre les isoformes de RAF. On peut noter l’existence d’une courte région localisée devant le domaine kinase, qui régule l’activation, appelée la N-région (pour marquer la présence de charges négatives à ce niveau). Plusieurs phosphorylations exerçant un rôle activateur sont concentrées dans la N-région, en particulier les résidus Ser 338 et Tyr 340 de C-RAF. Les phosphorylations activatrices directes de C-RAF portent également sur la boucle effectrice (Thr 491 et Ser 494). Le résidu Ser 621 constitue un résidu important pour le recrutement des protéines de la famille 14-3-3, car sa phosphorylation permet la formation de dimères entre C-RAF et B-RAF, ce qui constitue une étape importante de l’activation de ces kinases.

Figure 1 Structure des kinases RAF. Les isoformes de RAF (A-RAF, B-RAF, C-RAF) partagent trois régions conservées (les conserved regions CR1, CR2 et CR3). Le CR1 consiste en un domaine d’interaction avec RAS (Ras binding domain, RBD) suivi par un domaine riche en Cys (cystein rich domain, CRD), le CR2 est une région riche en résidus sérine/thréonine, et le CR3 porte l’activité kinase. Globalement, les kinases RAF sont ainsi organisées en deux parties fonctionnelles : un domaine aminoterminal régulateur, incluant CR1 et CR2, et un domaine carboxy-terminal catalytique. La présence d’une extension amino-terminale constitue la principale différence entre les isoformes de RAF. On peut noter l’existence d’une courte région localisée devant le domaine kinase, qui régule l’activation, appelée la N-région (pour marquer la présence de charges négatives à ce niveau). Plusieurs phosphorylations exerçant un rôle activateur sont concentrées dans la N-région, en particulier les résidus Ser 338 et Tyr 340 de C-RAF. Les phosphorylations activatrices directes de C-RAF portent également sur la boucle effectrice (Thr 491 et Ser 494). Le résidu Ser 621 constitue un résidu important pour le recrutement des protéines de la famille 14-3-3, car sa phosphorylation permet la formation de dimères entre C-RAF et B-RAF, ce qui constitue une étape importante de l’activation de ces kinases.

Chez les vertébrés, les kinases RAF sont généralement exprimées dans tous les tissus, mais à des niveaux différents [1]. Les isoformes de RAF diffèrent entre elles en termes d’activité kinase. Toutes trois sont capables d’activer une unique cible, MEK1/2 (voir Glossaire), mais présentent d’importantes différences d’activité vis-à-vis de ce substrat [ 2– 6]. Globalement, B-RAF est la kinase la plus active et constitue probablement le principal activateur physiologique de la cascade MEKERK. La distribution subcellulaire des isoformes est également différente, notamment au niveau des membranes cellulaires. Alors que C-RAF interagit avec la mitochondrie, A-RAF est présent au niveau endosomal, et B-RAF est cytosolique [ 7]. L’ensemble de ces particularités suggère que, au-delà de la capacité partagée à activer MEK, chaque isoforme est impliquée dans des régulations cellulaires spécifiques.

L’interaction des GTPases RAS avec les kinases RAF est un événement critique pour leur activation. Suivant un modèle généralement accepté, cette interaction active directement les kinases RAF en prévenant une interaction inhibitrice entre les domaines amino-terminal régulateur et carboxy-terminal kinase [ 8, 9]. En plus de leur effet activateur direct, les petites protéines G de la famille RAS favorisent le recrutement des kinases RAF au niveau de structures membranaires spécialisées consistant en un regroupement local des isoformes de RAS entre elles [ 10]. À ce niveau, la présence de protéines d’échaffaudage comme KSR (kinase suppressor of Ras) et l’activité moindre des phosphatases facilitent la signalisation par les kinases RAF [10, 11].

En plus de l’interaction avec RAS, les phosphorylations/ déphosphorylations jouent un rôle régulateur essentiel pour l’activité des RAF. Une région concentre plusieurs sites de phosphorylations stimulant directement l’activité des RAF kinases : il s’agit de la région N (negatively charged), en amont du domaine catalytique, qui joue un rôle régulateur important de l’activité kinase (Figure 1). Malgré la récente détermination de la structure cristalline du domaine catalytique de B-RAF [ 12], il n’existe que peu de données structurales pour expliquer l’effet régulateur direct des phosphorylations sur les RAF. De plus, certaines phosphorylations régulent indirectement l’activité kinase en changeant l’interaction des RAF avec d’autres protéines : en particulier, les protéines de la famille 14-3-3 qui reconnaissent des ligands phosphorylés et interagissent avec les kinases RAF. Elles permettent la formation de dimères entre les différentes kinases RAF, ce qui constitue une modalité importante de leur régulation [ 13]. À ce jour, les kinases MEK1/2, qui font partie du complexe d’activation de RAF, constituent l’unique substrat direct connu de ces kinases. Les kinases RAF ne régulent qu’indirectement leurs autres nombreux substrats, par l’intermédiaire de la cascade des kinases MEK-ERK.

Le rôle des kinases RAF dans la survie cellulaire a été clairement mis en évidence par les expériences d’invalidation des gènes codant pour CRaf et B-Raf chez la souris. L’invalidation de l’un ou l’autre de ces deux gènes cause une létalité embryonnaire. En l’absence de C-Raf, des niveaux d’apoptose importants sont observés dans plusieurs tissus, en particulier hépatique [ 14]. De la même façon, l’absence de B-Raf affecte la survie des cellules neuronales [ 15, 16]. Ces travaux ont permis de mettre en évidence le rôle fondamental des kinases RAF dans le contrôle de la survie cellulaire. Dans les paragraphes qui suivent, nous faisons le point sur les mécanismes impliqués en présentant les cibles cytoplasmiques et nucléaires des voies RAF.

Substrats cytoplasmiques régulant la survie cellulaire

La mitochondrie est l’organite essentiel dans la régulation de l’apoptose [ 17] et intègre l’essentiel des stimulus pro ou anti-apoptotiques. La perméabilisation de la membrane externe mitochondriale est une étape critique de l’exécution du programme apoptotique. Cette perméabilisation est sous le contrôle des protéines de la famille BCL2¹ (B-cell lymphoma 2) [17]. Des travaux menés dès la fin des années 1990 ont mis en évidence la présence de C-RAF au niveau des mitochondries et l’effet anti-apoptotique de cette kinase (revue dans [ 18]). Depuis, de nombreuses études ont montré [18] que les kinases RAF régulent les protéines de la famille BCL2 [ 19]. Suivant les tissus et les types cellulaires étudiés, les kinases MEK-ERK activées en aval des RAF sont capables de neutraliser les protéines pro-apoptotiques comme BAD (BCLXL/BCL2-associated death promoter) ou BIM (Bcl-2 interacting mediator of cell death) (Figure 2) et/ou d’activer les membres antiapoptotiques de cette famille de protéines comme BCL2 ou MCL1 (myeloid leukemia cell differentiation protein 1) [19]. Des mécanismes combinés de neutralisation directe et le contrôle du turn-over de ces protéines par le protéasome contribuent à inactiver les facteurs pro-apoptotiques. Ainsi, la voie RAF séquestre BAD dans le cytoplasme en créant un site d’interaction avec les protéines de la famille 14-3-3. La phosphorylation de BIM en aval de la voie RAF crée un site de reconnaissance pour l’ubiquitine ligase β-TRCP, favorisant de ce fait la dégradation de la protéine [19]. Au final, les kinases RAF préviennent donc l’activation de la machinerie apoptotique mitochondriale en contrôlant à la fois les niveaux d’expression et l’activité des protéines de la famille BCL2 par l’intermédiaire de la cascade MEK-ERK.

Figure 2 Schéma récapitulatif des voies de survie cytoplasmiques dépendantes de C-RAF. C-RAF active plusieurs voies de survie qui rendent compte de ses effets anti-apoptotiques. L’activation de la cascade C-RAF-MEK-ERK réprime les protéines BAD et BIM appartenant au groupe des protéines pro-apoptotiques BH3-only de la famille BCL2, et neutralise l’activité de la caspase 9 qui joue un rôle d’initiateur en relais de la libération du cytochrome c par la mitochondrie. En parallèle, C-RAF est capable de bloquer plusieurs kinases pro-apoptotiques, comme MST2, ASK1 ou ROKα, cette fois de façon indépendante de son activité kinase.

Figure 2 Schéma récapitulatif des voies de survie cytoplasmiques dépendantes de C-RAF. C-RAF active plusieurs voies de survie qui rendent compte de ses effets anti-apoptotiques. L’activation de la cascade C-RAF-MEK-ERK réprime les protéines BAD et BIM appartenant au groupe des protéines pro-apoptotiques BH3-only de la famille BCL2, et neutralise l’activité de la caspase 9 qui joue un rôle d’initiateur en relais de la libération du cytochrome c par la mitochondrie. En parallèle, C-RAF est capable de bloquer plusieurs kinases pro-apoptotiques, comme MST2, ASK1 ou ROKα, cette fois de façon indépendante de son activité kinase.

D’autres mécanismes cytoplasmiques sont également mis en jeu dans la régulation négative de l’apoptose. La phosphorylation du résidu thréonine 125 de la caspase-9 par les kinases ERK réduit l’activation de cette caspase [ 20]. De ce fait, les kinases RAF sont encore capables de prévenir l’apoptose en aval de la libération du cytochrome c. Finalement, d’autres mécanismes anti-apoptotiques ont été mis en évidence pour C-RAF. Ceux-ci présentent une particularité importante, à savoir leur indépendance vis-à-vis de l’activité kinase de C-RAF et, a fortiori, vis-à-vis de la cascade MEK-ERK. Ces effets anti-apoptotiques reposent sur la régulation négative par interaction physique de C-RAF avec plusieurs sérine/thréonine kinases qui exercent plus ou moins directement des effets pro-apoptotiques : les kinases MST2 (voir Glossaire) [ 21], ASK1 [ 22], ou ROKα [ 23] (Figure 2). Dans ce dernier cas, l’inhibition en trans de ROKα par C-RAF semble capable d’influencer la structure du cytosquelette d’actine et, indirectement, la signalisation par les récepteurs de mort cellulaire comme FAS [ 24].

L’activation des kinases RAF constitue une des anomalies les plus fréquemment retrouvées dans les cancers humains [1, 41]. Le plus souvent, les kinases RAF sont activées par le biais de dérèglements de l’activité des récepteurs à activité tyrosine kinase (typiquement le récepteur de l’EGF, epidermal growth factor) ou des petites protéines G de la famille RAS (des mutations activatrices de ces GTPases sont fréquemment détectées dans les tumeurs du côlon ou du pancréas). Des mutations somatiques activatrices de B-RAF ont été plus récemment mises en évidence dans les mélanomes et certaines tumeurs de la thyroïde et du côlon. Une mutation en particulier, B-RAF V600E, est de loin la plus souvent retrouvée. Cette mutation, localisée sur la boucle activatrice de B-RAF, maintient la kinase sous forme constitutivement active [12].

De façon intéressante, des travaux récents ont mis en évidence d’importantes différences physiologiques entre les cellules cancéreuses porteuses d’oncogènes RAF activés indirectement (activation de récepteurs ou mutations de RAS) et celles qui possèdent les mutations activatrices de B-RAF [ 29, 30]. Les cellules tumorales porteuses de l’oncogène B-RAF V600E présentent un phénomène d’addiction, c’est-à-dire de dépendance à des niveaux soutenus d’activation de la kinase MEK pour leur survie et leur croissance [29, 30]. Des données récentes indiquent que les altérations d’expression et d’activation des protéines régulant l’apoptose, et notamment les protéines de la famille BCL2, jouent un rôle essentiel dans les phénomènes d’addiction des cellules cancéreuses vis-à-vis des voies de transduction oncogéniques [19, 31]. Les cellules tumorales de mélanomes ou de cancers du côlon porteuses d’un oncogène B-RAF mutant V600E sont capables d’inactiver BAD et BIM de façon dépendante de MEK et le blocage de MEK induit des niveaux accrus d’apoptose dans ces cellules [ 32– 34]. Sur la base de ces nouvelles données, des travaux récents suggèrent l’efficacité d’un nouveau type d’association pharmacologique dans le traitement des cancers, avec d’une part des composés interférant avec les protéines BCL2, et d’autre part les thérapies ciblées antagonisant la voie RAF [ 35]. Nous résumons dans le Tableau I les principales études rapportant un effet pro-apoptotique synergique entre le blocage de la voie RAF et le traitement par ABT-737, le principal inhibiteur à ce jour des protéines BCL2 [ 36– 38]. Pour l’essentiel, les études évaluant ces synergies rapportent des résultats obtenus in vitro. Il existe encore peu d’études qui reposent sur des modèles animaux de tumeurs [38].

Tableau I Principales études mettant en évidence une synergie pro-apoptotique entre les inhibiteurs de la voie des kinases RAF et le composé BH3-mimétique ABT-737.

Tableau I Principales études mettant en évidence une synergie pro-apoptotique entre les inhibiteurs de la voie des kinases RAF et le composé BH3-mimétique ABT-737.

Conformément à une conception émergente dans le domaine de la signalisation intracellulaire, les kinases RAF constituent des points de convergence dans la régulation de la survie cellulaire [ 39]. Une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu par ces kinases dans les cellules cancéreuses est requise pour comprendre leur rôle oncogénique. Ces recherches seront essentielles pour améliorer les traitements actuels des cancers, car provoquer la mort des cellules cancéreuses est une condition obligatoire pour obtenir une régression de ces tumeurs. Dans cette optique, des recherches prometteuses visent à identifier les mécanismes anti-apoptotiques qui pourraient être à l’origine de l’addiction des cellules cancéreuses aux kinases MEK, ou à identifier d’éventuels talons d’Achille de ces cellules, comme par exemple les anomalies du métabolisme [ 40]. Près de vingt-cinq ans après leur découverte, les kinases RAF constituent toujours un champ ouvert pour des recherches qui devraient être fertiles !

Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts concernant les données publiées dans cet article.

Nous remercions la Ligue contre le cancer - comité de la Somme - pour son soutien financier.