Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) de la moelle osseuse ont été identifiées par Alexandre Friedenstein qui décrivit, dans les années 1960, des cellules immatures de la moelle osseuse de souris capables de développer, après implantation sous la capsule rénale, du tissu fibreux, de l’os, et de l’os plus de la moelle osseuse [ 1]. L’utilisation de souris chimériques lui permit de montrer que les cellules du tissu fibreux et de l’os provenaient du donneur, tandis que les cellules hématopoïétiques de la moelle provenaient du receveur, indiquant ainsi que certains des précurseurs mésenchymateux avaient une fonction stromale de soutien de l’hématopoïèse. D’autres investigateurs ont confirmé l’existence de précurseurs mésenchymateux capables de se différencier non seulement en ostéoblastes (O), mais également en chondrocytes (C) et en adipocytes (A). Il est convenu de les nommer cellules souches mésenchymateuses. Nous discuterons plus loin les critères qui justifient, ou non, cette qualification.

Les CSM sont obtenues chez l’homme par un procédé très simple. Après ponction médullaire, les cellules sont mises en suspension et ensemencées dans des boîtes de culture dans un milieu liquide additionné de sérum (humain ou bovin), sélectionné pour obtenir la croissance optimale des cellules adhérentes, en présence ou non de 1-2 ng/mL de FGF2 (fibroblast growth factor 2). L’élimination de l’ensemble des cellules non adhérentes s’effectue vers le deuxième jour. Les cellules prolifèrent jusqu’à la confluence, observée vers J20 (Figure 1). Si l’ensemencement initial est fait à faible densité, des clones indépendants issus d’une seule cellule appelée CFU-F (colony-forming unit fibroblast) sont détectables. Les CFU-F représentent une très faible proportion (0,1 à 0,001 %) des cellules nucléées de la moelle osseuse [ 2, 3].

De nombreux travaux ont étudié le phénotype membranaire des cellules obtenues à confluence et au cours de passages suivants. Ces études ont clairement montré que les cellules adhérentes constituaient une population de cellules mésenchymateuses distincte des populations hématopoïétiques ou endothéliales. Plus de 50 protéines de membrane caractérisent les CSM cultivées dans les conditions standardisées établies par les équipes du projet européen Genostem [3, 4]. Il convient de souligner que, comme pour d’autres populations cellulaires, aucun de ces marqueurs ne peut être considéré individuellement comme spécifique des CSM et que l’ensemble des marqueurs n’est pas suffisant pour définir la population en l’absence des critères fonctionnels de différenciation en précurseurs adipocytaires, ostéogéniques et chondrogéniques.

Les marqueurs CD73, CD90 (antigène Thy-1), CD105 (endogline), CD146 (melanoma cell adhesion molecule, MCAM ou glycoprotéine MUC18) et CD200 présents sur les CSM natives permettent leur enrichissement [3]. Cet enrichissement sera d’autant plus élevé en CFU-F (d’un facteur supérieur à 100 par rapport à la fraction de départ de cellules mononuclées) qu’on aura, dans une première étape, éliminé, par sélection négative, la plupart des cellules hématopoïétiques CD45⁺.

L’identification des CSM doit comporter la démonstration au niveau clonal que ces cellules peuvent se différencier en précurseurs adipocytaires (A), ostéogéniques (O) et chondrogéniques (C). Les cellules sont cultivées en présence d’inducteurs appropriés. La différenciation est évaluée par des méthodes histochimiques (colorations spécifiques) et par l’expression de facteurs de transcription clés des différentes voies (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma [PPARG] pour A, RUNX2 pour O et SOX9 pour C) et de certaines molécules des programmes de différenciation en aval des facteurs de transcription. Certains investigateurs recommandent de montrer aussi que les cellules sont capables, après implantation sous-cutanée dans des souris immunodéficientes, de développer des foyers osseux (contenant ou non des logettes hématopoïétiques) et de donner naissance in vivo à des adipocytes [ 5]. On ne saurait assez insister sur l’obtention de l’ensemble de ces critères fonctionnels pour l’identification d’une population cellulaire en tant que CSM.

Deux autres caractéristiques définissent de façon exhaustive les CSM : leur capacité d’immunosuppression et leur potentiel stromal. Bien que ces propriétés soient essentielles au plan clinique, leur mise en évidence n’est pas utilisée pour la qualification de ces cellules.

Les propriétés immunosuppressives sont d’autant plus étudiées que, non seulement elles permettent de traiter des pathologies telles que la maladie du greffon contre l’hôte, mais aussi ouvrent la voie à l’utilisation allogénique des CSM [ 6, 7, 38] (→). Ces effets immunomodulateurs complexes, validés in vitro et in vivo, s’expliqueraient non seulement par des interactions directes de type paracrine entre les CSM et les cellules immunitaires que sont les lymphocytes T, les cellules dendritiques et les cellules natural killer (NK), mais aussi par des effets indirects en modulant la capacité de réponse de certaines cellules immunitaires vis-à-vis d’autres cellules immunitaires (par exemple entre les cellules dendritiques et les lymphocytes T). Ces effets seraient dus à la sécrétion par les CSM de multiples molécules de nature très différente telles que les prostaglandines (notamment la PGE2), des enzymes (enzyme IDO pour indoleamine 2,3-dioxygénase ou HO pour hème oxygénase), la forme soluble d’HLA-G, des facteurs de croissance (transforming growth factor [TGF-β], hepatocyte growth factor [HGF] ou le nitric oxide [NO]).

(→) Voir l’article de C. Ménard et K. Tarte, page 269 de ce numéro

La façon la plus simple d’étudier la fonction stromale des CSM est de les cocultiver avec différentes populations de précurseurs hématopoïétiques (CD34⁺CD38⁻ par exemple) et d’observer la formation d’îlots d’hématopoïèse. Des données récentes de l’équipe de Paolo Bianco ont également mis en évidence la fonction stromale in vivo [ 8]. Pour ce faire, des cellules CD146⁺CD90⁺CD45⁻ ont été implantées en sous-cutané dans des souris immunodéficientes, ce qui a permis de constater que les cellules CD146⁺ se logeaient sous l’endothélium (lui-même d’origine murine) des sinus en formation et que les premiers foyers d’hématopoïèse se développaient au contact de ces cellules stromales sous-endothéliales.

Des cellules similaires aux CSM de moelle osseuse sont présentes dans beaucoup d’autres tissus [ 9]. La première différence dans l’obtention de ces cellules, comparativement au procédé décrit ci-dessus pour obtenir des CSM de moelle osseuse, est la nécessité de digérer le tissu par des enzymes protéolytiques. Cette problématique de digestion est aussi validée pour tous les tissus solides à partir desquels de nombreux groupes ont isolé des cellules de type CSM. Parmi les nombreux tissus étudiés, de plus en plus de groupes se focalisent sur le tissu adipeux étant donné sa facilité de prélèvement en grande quantité par liposuccion. Le procédé d’isolement à partir de tissu adipeux de précurseurs capables de se différencier en adipocytes a été décrit dès les années 1960 [ 10]. Ces cellules sont depuis appelées ASC pour adipose derived stroma/stem cells (Figure 1). L’étape de digestion est cruciale pour libérer les cellules de la matrice extracellulaire mais elle induit de grandes différences dans les populations obtenues en fonction du protocole et des enzymes protéolytiques utilisées. Il est d’autant plus nécessaire de garder à l’esprit que l’isolement de populations cellulaires distinctes dues à l’utilisation de protocoles différents peut expliquer des résultats expérimentaux variables, un point qui est souvent négligé (Figure 2). Après digestion, les adipocytes qui, remplis de lipides, flottent dans la suspension cellulaire sont éliminés de la fraction dite stromale-vasculaire du tissu. Cette fraction correspond à une population cellulaire hétérogène qui contient, entre autres, des cellules hématopoïétiques, des cellules endothéliales et des cellules immatures. La mise en culture de cette fraction et le milieu utilisé permettent aux cellules de type mésenchymateux d’adhérer et ainsi d’être sélectionnées par lavage comme pour les cultures établies à partir de la moelle osseuse. Cependant, un tel procédé ne correspond pas à une purification comme on peut l’attendre d’un tri par cytométrie de flux. Ces étapes sont pour la plupart effectuées à la main bien que l’on assiste actuellement à l’apparition de machines pour automatiser et surtout standardiser le procédé.

La fréquence des ASC dans le tissu adipeux est 100 à 500 fois supérieure à celle des CSM dans la moelle osseuse. Similaires sur de nombreux points, ces deux types de cellules présentent toutefois plusieurs différences. La première d’entre elles est que les ASC expriment la protéine CD34 au moins en début de culture, ce qui n’a pas été décrit pour les CSM de moelle osseuse humaine. Capables de se différencier en A, O, C et cellules vasculaires musculaires lisses (V), les ASC semblent avoir un potentiel angiogénique supérieur. Enfin, des analyses du transcriptome et du protéome effectuées dans des conditions de culture strictement comparables montrent bien que CSM et ASC, si elles présentent de nombreuses similitudes, ne sont pas identiques [ 11]. Des résultats comparables ont été trouvés pour des cellules de type CSM d’autres tissus [ 12].

La multipotence est une propriété des CSM admise par tous puisque ces cellules sont, dans leur définition même, capables de se différencier en A, O et C. De plus, de nombreux articles indiquent que les CSM sont également capables de générer des cellules vasculaires musculaires lisses (V); la voie V est celle suivie par les cellules stromales en culture à long terme. Les CSM de moelle osseuse peuvent donc être considérées comme « quadripotentes » pour les lignages A, O, C et V. Il faut souligner ici que la multipotence doit être strictement démontrée au niveau clonal. En effet, l’observation qu’une population multiclonale donne plusieurs lignages peut s’expliquer par la coexistence de populations unipotentes, chacune pour un des quatre lignages.

Il est ainsi attendu que les CSM puissent régénérer l’os et le cartilage lésés, ce qui a été largement démontré dans de nombreux modèles précliniques, dont celui de l’ostéogenèse imparfaite [ 20], et par quelques essais cliniques [ 40] (→). Il est aussi attendu que les CSM puissent participer à la reconstruction de la vasculature, ce qui a été démontré dans quelques études récentes in vitro et in vivo [ 21, 41] (→→).

(→) Voir l’article de F. Deschaseaux, page 278 de ce numéro

(→→) Voir l’article de C. Vinatier et al., page 289 de ce numéro

Certains articles rapportent un potentiel de différenciation plus large, confinant dans quelques cas à celui des cellules souches embryonnaires : différenciation en cellules endothéliales, en cellules musculaires squelettiques et cardiaques, en cellules neurales, en hépatocytes et en cellules épithéliales.

Ces observations de CSM à très large potentiel de différenciation posent trois types de question : celui d’une reprogrammation partielle éventuelle, celui de l’origine embryonnaire des CSM, et enfin celui de la sélection dans des conditions de culture spécifiques de cellules pluripotentes.

Dans certaines études où la différenciation est observée in vivo, un processus de fusion avec des cellules différenciées présentes dans les sites de nichage des CSM paraît avoir eu lieu [ 22]. Dans d’autres études, les CSM ont été partiellement reprogrammées par traitement in vitro [ 23].

Cependant, le processus de reprogrammation ne peut expliquer l’ensemble des observations. Bien que dans des conditions de culture standardisées mises au point dans le cadre du programme européen Genostem nous n’ayions obtenu de différenciation que selon les voies A, O, C et V [4], il reste possible que des conditions de culture spécifiques sélectionnent des populations rares de cellules ayant un potentiel élargi. Ceci pourrait être le cas pour les cellules à différenciation neurale. En effet, un ensemble de données indique qu’une sous-population de CSM murines serait d’origine, non pas mésodermique comme habituellement supposé, mais neuroectodermique, et ce, non seulement au cours du développement, mais aussi dans la moelle osseuse adulte [ 24]. Cette origine est cohérente avec l’origine neuroectodermique des tissus conjonctifs (incluant os et cartilage) de la partie supérieure du corps. Pour ce qui est des différenciations selon les voies endodermiques, on peut évoquer la sélection de cellules susceptibles de développer une transition épithélio-mésenchymateuse. De telles cellules ont été détectées dans le foie fœtal, mais n’ont pas été rapportées dans la moelle osseuse.

Reste l’hypothèse de la sélection de cellules médullaires pluripotentes dans des conditions particulières de contrôle strict du degré de confluence, d’hypoxie, de sélection extensive d’un lot de sérum particulier, de conditions de stress telle une incubation prolongée dans une solution de trypsine [ 25, 26]. De telles cellules pourraient être des vestiges de cellules souches embryonnaires ayant niché dans la moelle osseuse, ou pourraient résulter d’une reprogrammation plus ou moins complète selon un processus qui reproduirait in vivo l’induction in vitro des induced pluripotent cells.

Le point de démonstration le plus délicat concerne l’autorenouvellement. Une étude récente montre que les CFU-F CD146⁺CD90⁺ sont capables de s’autorenouveler [8]. En effet, après implantation d’une colonie de ce type en sous-cutané dans une souris immuno-déficiente, et récupération de l’implant après quelques semaines, un tri cellulaire a permis d’isoler une population très minoritaire de cellules CD146⁺CD90⁺ qui, après culture, a pu générer deux CFU-F à partir d’une seule. Reste à démontrer un autorenouvellement extensif, ce qui suppose l’utilisation de receveurs secondaires, voire tertiaires. Le faible taux de renouvellement du tissu mésenchymateux en condition stationnaire par rapport, par exemple, à l’hématopoïèse et la plasticité des CSM sont des limitations théoriques à la nécessité pour ces cellules de s’autorenouveler extensivement (voir plus loin).

Il est connu de longue date que les cellules mésenchymateuses peuvent transiter d’un état de différenciation dans un autre sous l’influence de facteurs extracellulaires. Les chondrocytes de la plaque intermédiaire s’hypertrophient avant de se transformer en ostéoblastes. Des clones de CSM différenciés en A, O, C ou V peuvent donner des cellules de lignage mésenchymateux alternatif après modification des conditions de culture [ 27, 28]. Compte tenu de l’homogénéité de la population cellulaire avant toute modification des conditions de culture, il est peu probable que ces résultats s’expliquent par la prolifération de CSM résiduelles. Il est probable que les transitions passent par un état de dédifférenciation, des investigateurs ayant montré la capacité des cellules mésenchymateuses différenciées à se dédifférencier lorsqu’on passe d’un milieu de culture différenciant à un milieu de prolifération [ 29]. La plasticité des CSM constitue un exemple extrême de flexibilité des propriétés des cellules souches [39] (→). Plasticité et autorenouvellement sont deux propriétés compétitives, mais non exclusives. En effet, la possibilité pour une cellule dans la descendance d’une cellule souche de récupérer de novo un potentiel complet de différenciation rend caduque la nécessité d’une grande capacité d’autorenouvellement pour maintenir le potentiel souche. Les modèles hiérarchiques de différenciation, où les cellules souches sont des entités prédéfinies donnant naissance à des populations discrètes de progéniteurs et de précurseurs (comme dans le système hématopoïétique), ne sont pas compatibles avec un processus de dédifférenciation [39] (→→).

(→) Voir l’article de D. Zipori, page 303 de ce numéro

(→→) Voir l’article de D. Zipori, page 303 de ce numéro

D’autres modèles peuvent s’appliquer, notamment ceux qui prennent en compte le phénomène de bruit dû aux variations stochastiques des niveaux d’expression de certains gènes ou réseaux de gènes [18].

Le phénomène de plasticité s’intègre bien au modèle de lineage priming des CSM [28]. Selon ce modèle, explicité en premier lieu pour les cellules souches hématopoïétiques (CSH), les cellules souches expriment, avant toute induction de différenciation vers leurs différents lignages, certains gènes caractéristiques de ces lignages, dont certains facteurs-clés de transcription. Ainsi, les CSM expriment, avant toute induction de différenciation, PPARG, RUNX2 et SOX9. La différenciation se traduit par l’augmentation du facteur correspondant à la voie induite et la diminution des facteurs des voies alternatives. Le modèle de lineage priming instruit sur le potentiel de différenciation, introduit l’hypothèse d’oscillations entre différents états intermédiaires et implique la réduction du nombre de gènes à induire pour compléter les programmes de différenciation. En outre, l’expression des facteurs-clés de transcription des lignages de différenciation montre que leurs gènes correspondants sont en conformation ouverte et donc accessibles aux molécules de remodelage de la chromatine ou aux coactivateurs transcriptionnels susceptibles de modifier l’équilibre qui prévaut entre eux.

En conclusion, les CSM peuvent être considérées comme d’authentiques cellules souches si on considère l’ensemble des quatre critères énoncés plus haut. Dans la mesure où il existe une tension compétitive entre le critère autorenouvellement et le critère plasticité, CSH et CSM pourraient constituer deux extrêmes parmi les cellules souches tissulaires adultes : c’est l’autorenouvellement qui serait la propriété cardinale des CSH, alors que la plasticité serait l’attribut essentiel des CSM. À noter que les capacités immunosuppressive et stromale des CSM sont deux caractéristiques indépendantes du caractère souche, mais qui confèrent à ces cellules un intérêt clinique accru.

En ce qui concerne les cellules mésenchymateuses d’autres tissus, dont les ASC, la caractérisation de critères correspondant au phénotype souche n’a jamais été faite de manière aussi complète que pour les CSM. Si leur multipotentialité a été démontré in vitro au niveau clonal, leur capacité d’autorenouvellement reste à établir de façon définitive [ 30, 31].