Les cellules souches pluripotentes humaines sont communément associées à des applications de médecine régénératrice pour des maladies dégénératives. Elles présentent toutefois un tout autre potentiel qui peut offrir de nombreuses possibilités en santé publique : être utilisées pour permettre une meilleure compréhension des mécanismes de certaines pathologies humaines et, consécutivement, le développement de stratégies thérapeutiques adaptées. Grâce à leurs capacités d’autorenouvellement et de pluripotence, les cellules souches pluripotentes humaines représentent une source illimitée de cellules dont on peut induire la différenciation « à la demande » dans l’ensemble des types cellulaires de l’organisme. L’utilisation de cellules souches pluripotentes porteuses de la mutation causale d’une maladie humaine peut donc permettre de suivre l’apparition et la progression des processus physiopathologiques, en favorisant notamment l’identification de nouveaux acteurs cellulaires et moléculaires.

Bien que des travaux aient déjà apporté des résultats prometteurs en montrant que l’on pouvait répliquer dans des cellules dérivées de lignées de cellules souches pluripotentes des signes pathologiques connus, l’identification de mécanismes pathologiques jusqu’alors inconnus n’avait pas encore été démontrée. Notre équipe vient de relever doublement ce défi en révélant les mécanismes moléculaires à l’origine d’anomalies fonctionnelles jusque-là ignorées de la maladie de Steinert, à l’aide de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) porteuses de la mutation causale [ 1].

L’obtention de ces cellules repose actuellement sur deux méthodes : (1) la dérivation de CSEh à partir d’embryons obtenus par fécondation in vitro et écartés du programme de procréation à la suite d’un diagnostic pré-implantatoire (DPI) car porteurs de la mutation causale d’une maladie monogénique; (2) la conversion de cellules somatiques en cellules souches pluripotentes (hiPS, pour induced pluripotent stem cells) par manipulation génétique. En 2007, Nissim Benvenisty et ses collaborateurs ont été les premiers à démontrer que certains mécanismes moléculaires du syndrome de l’X fragile (X-Fra) pouvaient être reproduits dans les CSEh portant la mutation responsable [ 2]. À la suite de l’identification des techniques de reprogrammation génique [ 3], plusieurs équipes ont tenté de reproduire de la même façon les mécanismes de pathologies monogéniques à l’aide de lignées hiPS (Tableau I). Les hiPS partagent les propriétés cardinales des CSEh, l’immortalité et la pluripotence, mais des travaux récents démontrent que le processus de reprogrammation entraîne des modifications génétiques distinguant ces deux types cellulaires [ 4– 6], ce qui complique parfois l’interprétation des données. L’équipe de Benvenisty en a donné un exemple précis en révélant l’incapacité d’iPS provenant de patients X-Fra à répliquer les mécanismes pathologiques pourtant présents dans les cellules dérivées de CSEh [ 7].

Nos études fondées sur des cellules dérivées d’embryons issus du DPI s’inscrivent dans ce cadre général du développement du champ de la modélisation pathologique in vitro.

La maladie de Steinert ou dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est la plus fréquente des dystrophies musculaires héréditaires de l’adulte, avec une prévalence estimée à 1/8 000. Elle se caractérise principalement par un retard à la décontraction musculaire après stimulation nerveuse (myotonie), souvent associé à une atrophie musculaire, des troubles cardiaques, endocriniens, cognitifs, etc. À l’origine de cette maladie, on trouve une répétition anormale de triplets CTG dans la région 3’ transcrite non traduite du gène codant pour la myotonine ou DMPK (dystrophic myotonic protein kinase). Cette mutation est responsable de la formation d’inclusions intranucléaires ribonucléoprotéiques qui séquestrent des protéines normalement impliquées dans les processus de maturation d’ARNm. Ainsi, des défauts de transcription, d’épissage et de stabilité de certains ARNm ont été associés à plusieurs signes cliniques [ 8]. Cependant, la physiopathologie de cette maladie reste encore mal comprise, en particulier en ce qui concerne les mécanismes impliqués dans le syndrome myotonique.

Nous avons pu utiliser deux lignées CSEh dérivées à l’AZ-VUB (Academisch Ziekenhuis van de Vrije Universiteit, Bruxelles) à partir d’embryons distincts porteurs de la mutation causale de DM1. Nous avons, dans un premier temps, différencié les cellules CSEh en motoneurones grâce à un protocole d’induction neurale par coculture des CSEh avec des cellules stromales, suivi d’une spécification motoneuronale à l’aide d’agents induisant un phénotype caudal (acide rétinoïque) et ventral (sonic hedgehog). Dans ces conditions, nous avons obtenu 30 % à 40 % de neurones présentant une morphologie et un phénotype de motoneurones exprimant le marqueur nucléaire Hb9 (Figure 1A-B). Deux signes moléculaires caractéristiques de DM1, la présence des inclusions ribonucléiques et une anomalie d’épissage du gène codant pour le récepteur au glutamate de type NMDA, étaient présents tout au long de ce processus de différenciation [ 9]. Outre cette réplication de caractéristiques connues, nous avons fait une observation originale : une croissance anormalement profuse des prolongements neuronaux (Figure 1D). L’utilisation d’un système de coculture entre ces motoneurones et des cellules musculaires humaines a révélé de plus que cette arborisation exubérante des neurites s’accompagnait d’une diminution nette de leur capacité à former des synapses (Figure 1F). Il est intéressant de noter que ce phénotype anormal rappelle quelques observations anatomo-pathologiques réalisées chez des patients DM1 [ 10– 12].

Figure 1 Anomalies phénotypiques des motoneurones issus des cellules CSEh DM1. On observe une augmentation anormale de l’arborisation neuritique entraînant des défauts dans la capacité des motoneurones à interagir avec leur cible musculaire. A. Représentation schématique du protocole de différenciation des CSEh en motoneurones. La première étape de ce protocole se base sur une coculture entre les CSEh et des cellules stromales permettant l’induction neurale. Les précurseurs neuraux ainsi obtenus, sous la forme de rosettes neurales, sont traités par de l’acide rétinoïque ou Sonic hedgehog, deux facteurs connus pour leur rôle dans la différenciation cholinergique. La maturation terminale des motoneurones est ensuite induite, pendant 1 à 2 semaines, en maintenant les cellules en présence de facteurs de survie tels que le BDNF (brain-derived neurotrophic factor), le GDNF (growth-derived neurotrophic factor) et l’acide ascorbique. B. Une proportion (30 %) des neurones (détectés par immunomarquage pour TuJI) expriment le marqueur nucléaire spécifique des motoneurones Hb9 (en rouge). C. Détection par hybridation in situ des inclusions ribonucléoprotéiques (en rouge) au niveau des neurones détectés par immunomarquage pour le marqueur TuJI (en vert). Un exemple est illustré par la flèche blanche. D. La détection du marqueur pan neuronal MAP2 (en rouge) permet de révéler l’augmentation de l’arborisation neuritique dans les cultures neuronales issues des cellules CSEh DM1 par rapport aux CSEh contrôles (E). F. Les neurites des motoneurones DM1 (en vert, marqueur TuJI) se connectent moins bien aux cellules musculaires (en rouge, marqueur desmine) que des motoneurones contrôles (G). La flèche jaune illustre un exemple d’interaction neurone-cellule musculaire.

Figure 1 Anomalies phénotypiques des motoneurones issus des cellules CSEh DM1. On observe une augmentation anormale de l’arborisation neuritique entraînant des défauts dans la capacité des motoneurones à interagir avec leur cible musculaire. A. Représentation schématique du protocole de différenciation des CSEh en motoneurones. La première étape de ce protocole se base sur une coculture entre les CSEh et des cellules stromales permettant l’induction neurale. Les précurseurs neuraux ainsi obtenus, sous la forme de rosettes neurales, sont traités par de l’acide rétinoïque ou Sonic hedgehog, deux facteurs connus pour leur rôle dans la différenciation cholinergique. La maturation terminale des motoneurones est ensuite induite, pendant 1 à 2 semaines, en maintenant les cellules en présence de facteurs de survie tels que le BDNF (brain-derived neurotrophic factor), le GDNF (growth-derived neurotrophic factor) et l’acide ascorbique. B. Une proportion (30 %) des neurones (détectés par immunomarquage pour TuJI) expriment le marqueur nucléaire spécifique des motoneurones Hb9 (en rouge). C. Détection par hybridation in situ des inclusions ribonucléoprotéiques (en rouge) au niveau des neurones détectés par immunomarquage pour le marqueur TuJI (en vert). Un exemple est illustré par la flèche blanche. D. La détection du marqueur pan neuronal MAP2 (en rouge) permet de révéler l’augmentation de l’arborisation neuritique dans les cultures neuronales issues des cellules CSEh DM1 par rapport aux CSEh contrôles (E). F. Les neurites des motoneurones DM1 (en vert, marqueur TuJI) se connectent moins bien aux cellules musculaires (en rouge, marqueur desmine) que des motoneurones contrôles (G). La flèche jaune illustre un exemple d’interaction neurone-cellule musculaire.

Afin de comprendre les mécanismes moléculaires associés à ces phénotypes, nous avons identifié les gènes différentiellement exprimés entre les cellules mutées et contrôles. Nous avons ainsi identifié deux gènes codant pour des membres de la famille SLITRK¹, connue pour son rôle dans la croissance neuritique, dont l’expression était totalement effondrée. Nous avons retrouvé ce déficit, jusque-là inconnu, dans des prélèvements de tissu cérébral provenant de patients. Nous avons établi le lien causal entre la perte d’expression des SLITRK et l’anomalie neuritique en restaurant une activité normale de ces protéines dans les cellules DM1, ce qui a normalisé le défaut fonctionnel, l’arborisation neuritique excessive (Figure 2). À l’inverse, l’extinction des gènes à l’aide de shARN dans des cellules sauvages provoquait la pousse neuritique exubérante typique de la pathologie (Figure 2).

Figure 2 Lien causal entre le défaut d’arborisation neuritique et le défaut d’expression de deux gènes de la famille SLITRK dans les progéniteurs neuraux issus de cellules CSEh DM1. A. Dans les cultures de neurones issus de CSEh DM1, il y a absence d’expression des gènes SLITRK2 et SLITRK4, aboutissant à une augmentation du réseau neuritique. B. La surexpression à l’aide de vecteurs lentiviraux des gènes SLITRK2 et SLITRK4 dans les cultures neuronales DM1 aboutit à une diminution du réseau neuritique similaire à celui observé dans les cultures contrôles (C). D. L’extinction, par shARN, de l’expression des gènes SLITRK2 et SLITRK4 aboutit dans des cultures neuronales contrôles à une augmentation de l’arborisation neuritique.

Figure 2 Lien causal entre le défaut d’arborisation neuritique et le défaut d’expression de deux gènes de la famille SLITRK dans les progéniteurs neuraux issus de cellules CSEh DM1. A. Dans les cultures de neurones issus de CSEh DM1, il y a absence d’expression des gènes SLITRK2 et SLITRK4, aboutissant à une augmentation du réseau neuritique. B. La surexpression à l’aide de vecteurs lentiviraux des gènes SLITRK2 et SLITRK4 dans les cultures neuronales DM1 aboutit à une diminution du réseau neuritique similaire à celui observé dans les cultures contrôles (C). D. L’extinction, par shARN, de l’expression des gènes SLITRK2 et SLITRK4 aboutit dans des cultures neuronales contrôles à une augmentation de l’arborisation neuritique.

Ces résultats démontrent ainsi le potentiel offert par les CSEh pour disséquer des mécanismes jusque-là inconnus de pathologies humaines. Ils soulignent en particulier la possibilité qu’offrent ces cellules d’identifier des anomalies aussi fines que celles pouvant affecter la communication intercellulaire. Le développement de nombreux protocoles de différenciation permettant d’obtenir un nombre important de phénotypes cellulaires différenciés ouvre largement ce champ d’exploration des maladies monogéniques, notamment de celles qui bénéficient d’un diagnostic pré-implantatoire.

Au-delà de cette recherche fondamentale, l’application directe de cette modélisation pathologique est la recherche de composés capables de corriger, ou de compenser, les anomalies ainsi identifiées. Chacune de ces anomalies représentatives des pathologies et que l’on retrouve in vitro dans la descendance des cellules souches pluripotentes est une cible potentielle pour le criblage des millions de composés amassés par les industriels de la pharmacie, à la recherche des hits à partir desquels pourront être développés les traitements appropriés à ces maladies génétiques qui, pour la plupart, n’ont pas jusqu’alors bénéficié de ces approches pharmacologiques à haut débit.

Ce travail a été soutenu par l’Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm), l’Association française contre les myopathies (AFM), la Région Île-de-France, le Génopole, Médicen (Programme IngeCell).