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Med Sci (Paris). 2012 January; 28(1): 55–61.
Published online 2012 January 27. doi: 10.1051/medsci/2012281017.

Basonuclines et protéines DISCO
Des régulateurs du développement des vertébrés et des insectes

Françoise Hervé,1 Amandine Vanhoutteghem,1 and Philippe Djian1*

1Unité de régulation de la transcription et maladies génétiques, CNRS et université Paris Descartes, 45, rue des Saints-Pères, 75006Paris, France
Corresponding author.
Découverte des protéines DISCO et des basonuclines : un bref historique

Les protéines DISCO des insectes et les basonuclines 1 et 2 (BNC1 et BNC2) des vertébrés constituent une famille de protéines nucléaires à doigts de zinc importante pour le développement embryonnaire et en pathologie humaine. Ces protéines sont apparentées essentiellement par la ressemblance de leurs doigts de zinc (Figure 1A) et par la similitude de leurs fonctions dans le développement des mammifères et des insectes, ce qui est inhabituel [ 1, 2].

L’histoire de ces protéines commence en 1987 par la découverte de la mutation disco chez la drosophile. Celle-ci entraîne une cécité résultant de l’incapacité des axones des photorécepteurs à innerver les lobes optiques embryonnaires, probablement parce que ces axones ne reconnaissent pas les neurones optiques [ 3]. Le clonage du gène disco révéla qu’il codait une protéine nucléaire à doigts de zinc et non une protéine d’adhésion, comme on aurait pu s’y attendre [ 4, 5].

BNC1 fut découverte par hasard en 1992 au cours d’une recherche de facteurs régulant la différenciation des kératinocytes humains. Elle fut nommée ainsi en raison de sa localisation nucléaire et de la spécificité de son expression dans les kératinocytes de la couche basale de l’épiderme. Il fut tout de suite remarqué que les trois paires séparées de doigts de zinc de BNC1 ressemblaient fortement à l’unique paire de doigts de zinc de DISCO, mais l’absence d’identité des deux types de protéines en dehors des doigts de zinc et leur distribution tissulaire très différente ne permirent pas de tirer de conclusions fonctionnelles quant à cette ressemblance [6].

En 2001, un deuxième gène disco fut découvert chez la drosophile, disco-r (disco-related), qui possédait deux paires séparées de doigts de zinc. Cette découverte eut lieu lors de la recherche de cofacteurs de la protéine homéotique DFD (DEFORMED), une protéine régulant le développement de la tête larvaire. Cette recherche révéla des délétions qui produisaient un phénotype voisin de celui de Dfd lorsqu’elles recouvraient deux gènes adjacents : disco et disco-r. Ainsi la protéine DISCO possède deux fonctions, l’une redondante avec DISCO-R dans le développement du squelette larvaire céphalopharyngé et l’autre unique dans le système visuel [ 7].

En 2004, la deuxième basonucline (BNC2) fut découverte, et ce simultanément par deux laboratoires, au cours d’analyses bioinformatiques. BNC2 est le seul paralogue de BNC1 [8, 9]. Enfin en 2009, la publication de nouvelles banques nucléotidiques d’insectes permit d’éclaircir les relations entre les basonuclines des vertébrés et les protéines DISCO des insectes [1].

Les basonuclines sont-elles les équivalents chez les vertébrés des protéines DISCO des insectes ?

Les gènes disco sont présents chez les insectes, mais pas chez les vertébrés, alors que c’est l’inverse pour ceux des basonuclines. La question se pose donc de la relation évolutive entre les gènes disco et ceux des basonuclines : sont-ils orthologues, c’est-à-dire issus d’un gène ancestral commun ? La réponse est clairement oui, mais paradoxalement, elle n’a été donnée qu’en 2009. Les doigts de zinc des basonuclines et ceux de la protéine DISCO de drosophile sont indiscutablement homologues (Figure 1A). Outre une identité de séquence qui dépasse 75 % entre les protéines humaines et de drosophile, les doigts de zinc ont des particularités communes : paires séparées, de type C2H2, avec un espacement inhabituel des deux histidines du deuxième doigt de zinc de chaque paire [ 10]. Cependant une question demeurait : pourquoi n’y avait-il aucune ressemblance en dehors des doigts de zinc ? C’est le séquençage du génome de plusieurs espèces non diptériennes d’insectes qui a permis de répondre à cette question [1, 2]. Les insectes non diptériens sont très éloignés des diptères qui incluent les moustiques et les mouches comme la drosophile. L’analyse du génome de ces insectes a permis de reconstituer la structure exonique de leurs gènes disco et d’en déduire la séquence protéique. Les protéines DISCO des insectes non diptériens ressemblent beaucoup plus aux basonuclines que celles de la drosophile. Il existe en particulier une région d’environ 150 acides aminés dans la région amino-terminale des basonuclines qui est présente dans les protéines DISCO non diptériennes. Cette région, que ce soit dans les basonuclines ou dans les protéines DISCO, est codée par trois exons qui sont interrompus par des introns localisés au même endroit (Figure 1B). Outre ces ressemblances de structure génique, nous verrons que la fonction de BNC2 dans le développement et sa distribution tissulaire suggèrent que cette protéine est l’orthologue fonctionnel vertébré des protéines DISCO des insectes.

L’analyse des séquences permet de retracer la généalogie des gènes disco et des gènes des basonuclines à partir d’un gène ancestral commun qui codait probablement deux paires de doigts de zinc, résultant elles-mêmes de la duplication d’une paire ancestrale (Figure 1C). Après sa divergence d’avec les arthropodes, un ancêtre commun aux chordés a ajouté une troisième paire de doigts de zinc, encore une fois par duplication d’une paire préexistante, et a ainsi engendré le gène primordial des basonuclines. Celui-ci a ensuite été dupliqué en bnc1 et bnc2 chez un ancêtre des vertébrés, de sorte que tous les vertébrés possèdent deux basonuclines alors que les protochordés n’en possèdent qu’une. L’évolution a été similaire chez les insectes, mais elle s’y est produite indépendamment de celle des vertébrés : il y a eu duplication d’un gène disco ancestral pour produire disco et disco-r. Une troisième paire de doigts de zinc a été ajoutée par duplication chez certains insectes comme le ver de farine (Tribolium). Il faut noter que DISCO de la drosophile ne possède que la première paire de doigts de zinc, probablement parce qu’elle a perdu la seconde.

Les particularités de l’évolution des protéines DISCO et des basonuclines suscitent un certain nombre de questions : BNC2, qui est très conservée au cours de l’évolution, a-t-elle conservé chez les vertébrés la fonction de DISCO et de l’unique basonucline des protochordés ? La duplication en bnc1 et bnc2 était-elle nécessaire afin de conserver la fonction essentielle de BNC2, BNC1 aurait ainsi été libre d’évoluer vers de nouvelles fonctions ? DISCO et DISCO-R ont des fonctions redondantes dans le développement céphalopharyngien, mais DISCO a de plus une fonction spécifique dans le lobe optique. BNC1 et BNC2 ont-elles de même des fonctions redondantes et des fonctions spécifiques ? Des éléments de réponse ont été apportés par l’analyse des distributions ­tissulaires de ces protéines et l’étude d’animaux mutants.

Fonctions communes et spécifiques des protéines DISCO et des basonuclines : importance pour le développement
Fonctions de BNC1 et BNC2 chez les mammifères
L’expression du gène bnc1 est limitée aux kératinocytes des épithéliums stratifiés squameux, aux cellules de l’épithélium cornéen [6] et aux cellules germinales mâles et femelles [ 11, 12]. Le seul phénotype clair décrit concerne les cellules germinales femelles. La phénocopie de bnc1 par des ARN interférents (knock-down) dans des ovocytes de souris entraîne une diminution de la fertilité et une altération des follicules ovariens [ 13]. Quelques ovocytes appauvris en BNC1 atteignent leur maturité mais, après insémination, la plupart des œufs fécondés ne dépassent pas le stade deux cellules : bnc1 est un donc gène à effet maternel qui joue un rôle essentiel dans l’ovogenèse et le développement embryonnaire précoce. Une mutation nulle a été réalisée chez la souris [ 14]. En dehors de la stérilité des souris femelles, le seul phénotype observé concerne la cornée dont les cellules épithéliales ont un potentiel prolifératif réduit. Il faut noter que la cornée de ce mutant se développe normalement et qu’aucun ­phénotype épidermique n’est décrit.

Le gène bnc2 a une expression tissulaire plus large que le gène bnc1. BNC2 coexiste avec BNC1 dans les cellules germinales et les kératinocytes, mais est également présente dans des tissus qui n’expriment pas le gène bnc1 comme le mésenchyme du palais, les gaines conjonctives, le périchondre et certaines cellules somatiques des gonades [1, 15]. L’invalidation de bnc2 chez la souris entraîne une létalité néonatale due à la présence d’une fente palatine. Les mutants bnc2−/− présentent également des anomalies osseuses craniofaciales avec une réduction en taille, voire une absence de certains os de la base crânienne (Figure 2A). BNC2 joue donc un rôle essentiel dans les cellules mésenchymateuses au cours de l’embryogenèse [1]. Il est possible que la létalité de la mutation masque d’autres phénotypes, affectant par exemple les cellules germinales mâles et femelles dans lesquelles BNC2 est très abondante (non publié). Une greffe des gonades bnc2 −/− chez des souris immunodéficitaires permettrait de déterminer si la maturation des cellules germinales est inhibée en l’absence de BNC2. L’hypothèse d’une fonction de BNC2 dans la reproduction est renforcée par la découverte récente d’un poisson zèbre bnc2−/− (phénotype bonaparte), isolé au cours d’une recherche de mutations pigmentaires induites par la nitroso-urée [15]. Les mutants adultes ont une taille réduite et aucune rayure pigmentée sur le corps. Les femelles bnc2−/− sont stériles et leurs ovaires présentent d’importantes anomalies somatiques.

BNC2 possède également une fonction dans la fermeture de la gouttière urétrale. Un patient chez lequel un hypospadias était associé à des anomalies de la croissance osseuse a été décrit récemment [ 16]. La symptomatologie résulte d’une translocation dont le point de cassure, situé dans le gène BNC2, entraîne la synthèse d’une protéine sans doigts de zinc, donc non fonctionnelle. Le patient est hétérozygote et sa symptomatologie résulte probablement d’une haploinsuffisance. Cette hypothèse est confirmée par l’étude des souris transgéniques : bnc2 est fortement exprimé dans les cellules mésenchymateuses péri-urétrales et les nouveau-nés bnc2−/− et bnc2+/- présentent des anomalies de fermeture de la gouttière urétrale analogues à celles du patient cité précédemment (Figure 3).

Fonctions de DISCO et DISCO-R
DISCO possède une fonction non partagée avec DISCO-R dans la connectivité des axones du système visuel de la drosophile ; c’est cette fonction qui lui a valu son nom : disco étant une apocope pour disconnected [3]. En outre, DISCO et DISCO-R possèdent des fonctions communes dans le développement du squelette céphalopharyngien de la larve de drosophile [7]. Cette dernière fonction semble s’appliquer aux insectes en général, puisqu’on la retrouve chez le coléoptère Tribolium [ 17]. Une double délétion des gènes disco et disco-r chez la drosophile est létale au stade embryonnaire. Les embryons de drosophile disco– et disco-r– présentent d’importantes anomalies de la tête avec une réduction en taille, voire une absence totale de la plupart des structures composant le squelette céphalopharyngien (Figure 2B). Ce phénotype rappelle celui des souris bnc2−/− (Figure 2A). De plus, certains lieux d’expression de disco sont identiques à ceux de bnc2 : cellules mésodermiques entourant l’estomac [5, 18] et articulations des pattes (Figures 2C et 2D).
Orthologie fonctionnelle entre BNC2 et DISCO ?
Au total, à la fois par sa structure primaire, sa distribution et sa fonction dans le développement de la tête, BNC2 semble représenter l’orthologue structural et fonctionnel vertébré des protéines DISCO. Une preuve irréfutable de cette orthologie fonctionnelle serait une restauration du phénotype sauvage chez les mutants grâce à la séquence de la protéine orthologue. D’où la question : existe-t-il un mécanisme d’action commun à BNC2 et aux protéines DISCO dans le développement céphalique des mammifères et des insectes ? Comme l’absence des protéines DISCO produit un phénotype très similaire à celui dû à l’absence de la protéine homéotique DFD, il a été émis l’hypothèse selon laquelle les protéines DISCO étaient des cofacteurs transcriptionnels de DFD. La protéine la plus voisine de DFD chez les mammifères est HOXA4, une protéine de la famille HOX [ 19] : BNC2 est-elle un cofacteur de HOXA4 ?

Comme pour DISCO et DISCO-R, le problème de la redondance possible des fonctions de BNC1 et BNC2 se pose dans les cellules où elles coexistent (ovocytes et kératinocytes). Dans les ovocytes, BNC2 ne compense pas le manque de BNC1 : les deux protéines y exercent donc des fonctions différentes [13]. En revanche, aucun phénotype affectant les kératinocytes n’a été décrit ni pour BNC1 ni pour BNC2 : les deux protéines ont-elles la même fonction dans les kératinocytes ? Une double invalidation serait alors nécessaire pour mettre en ­évidence ce phénotype.

Rôle des protéines DISCO et des basonuclines dans la prolifération cellulaire : implication dans certaines tumeurs

Il existe une corrélation entre la présence de BNC1 dans les kératinocytes et le potentiel prolifératif de ces cellules : BNC1 est spécifique des régions contenant les cellules souches (couche basale de l’épiderme et follicules pileux) [ 20]. En outre, l’ARNm de bnc1 est présent dans les holoclones, qui correspondent aux cellules souches épidermiques, et absent des méroclones et paraclones, qui représentent la descendance à faible capacité proliférative des holoclones [ 21]. Il n’a cependant jamais été démontré de manière directe que BNC1 contrôlait le potentiel prolifératif des cellules souches kératinocytaires.

L’invalidation de bnc2 a révélé la fonction essentielle de BNC2 dans la multiplication de certaines cellules mésenchymateuses au cours de l’embryogenèse tardive. Des études sur l’organisme entier ne peuvent pas distinguer si cette fonction s’exerce de façon directe ou indirecte, mais le fait que chez les souris sauvages, le gène soit fortement exprimé dans les cellules qui sont affectées chez les mutants est un argument en faveur d’une action directe [1]. La démonstration formelle que BNC2 contrôle la multiplication des cellules doit venir des cultures cellulaires : démonstration d’un défaut de prolifération des cellules bnc2−/− en culture et de sa correction par expression de l’ADNc bcn2 dans les cellules bnc2 −/−.

Dans le cas de DISCO, il n’existe que peu d’arguments quant à son rôle dans la multiplication cellulaire. La réduction de taille de certaines structures buccales des drosophiles disco- a fait émettre l’hypothèse d’un défaut de prolifération cellulaire [7]. En résumé, il est possible que les basonuclines et les protéines DISCO partagent une fonction dans la multiplication cellulaire, peut-être en activant des cibles géniques identiques par la fixation de leur première paire de doigts de zinc, mais une telle fonction n’est pas formellement démontrée.

Une fonction de BNC1 et BNC2 dans la prolifération cellulaire cadrerait bien avec le rôle présumé de ces protéines dans la multiplication des cellules cancéreuses. BNC1 et BNC2 sont très abondantes dans les épithéliomas basocellulaires [ 22, 23]. BNC2 a été impliquée dans l’évolution vers un adénocarcinome d’une métaplasie glandulaire du bas œsophage (maladie de Barrett)1 [ 24]. Des études récentes montrent une relation entre BNC2 et cancers de l’ovaire [ 25]. Une recherche de SNP (single nucleotide polymorphism) associés à une prédisposition aux cancers de l’ovaire a été réalisée dans la totalité du génome de plus de 15 000 patientes. Les onze SNP significatifs sont groupés dans la région 9p22.2, dont le seul gène est BCN2. BCN2 pourrait être considéré comme un gène de prédisposition au cancer de l’ovaire, au même titre que BRCA1 et BRCA2. La plupart des cancers ovariens ont pour origine la transformation des cellules somatiques de l’ovaire. La forte expression du gène BNC2 dans l’épithélium ovarien et la thèque folliculaire (P. Djian, résultats non publiés) est en accord avec un rôle de BNC2 dans la cancérogenèse ovarienne.

Fonctions moléculaires des protéines DISCO et des basonuclines

Les doigts de zinc constituent souvent des domaines de liaison à l’ADN, ce qui a conduit à suggérer que BNC1 pourrait agir comme régulateur de la transcription et à rechercher ses gènes cibles. Il a ainsi été démontré que BNC1 jouait un rôle dans la régulation de la transcription par l’ADN polymérase I via l’interaction de sa première paire de doigts de zinc avec le promoteur des gènes codant pour les ARN ribosomaux (ADNr) [ 26, 27]. BNC1 pourrait également réguler l’expression de gènes transcrits par l’ADN polymérase II (Pol II) comme le suggère sa localisation nucléoplasmique diffuse. Une vingtaine de gènes transcrits par Pol II et dont les promoteurs possèdent une séquence identique à celle qui lie BNC1 dans l’ADNr ont été identifiés, mais aucun effet biologique de BNC1 sur ces gènes n’a été démontré [ 28].

Le gène bnc2 subit un épissage alternatif important [ 29]. Grâce à des anticorps spécifiques, deux formes de la protéine pouvant être des isoformes d’épissage ont été observées. L’une a une localisation nucléoplasmique diffuse, comme BNC1, et pourrait agir comme facteur de transcription (P. Djian, résultats non publiés) ; l’autre est associée aux speckles (granules) où sont concentrés les facteurs d’épissage, et pourrait être impliquée dans la maturation des ARN pré-­messagers [ 30]. La première paire de doigts de zinc de BNC2 est quasiment identique à celle de BNC1, et les résidus faisant contact avec l’ADN sont les mêmes (Figure 1A). La liaison de BNC2 au promoteur des gènes des ARNr a été démontrée in vitro, mais, contrairement à BNC1, l’induction de la transcription de l’ADNr n’a pas été étudiée et reste donc à démontrer [9]. Au total, il semble que les doigts de zinc de BNC2 pourraient se lier à des cibles ADN ou ARN, et que la liaison dépende d’éléments de séquence situés en dehors des doigts de zinc et dont la présence ou l’absence résulterait de l’épissage ­alternatif du gène.

DISCO est nucléaire comme les basonuclines [5], mais aucun gène cible de DISCO n’a été identifié.

Conclusion

Les basonuclines et les protéines DISCO constituent un groupe intéressant de protéines régulatrices du développement des mammifères et des insectes. Elles ont la particularité de posséder des paires séparées de doigts de zinc. Il faut maintenant déterminer les cibles géniques des différentes paires et comprendre ainsi les mécanismes d’action moléculaire de ces protéines au cours du développement et de la cancérogenèse humaine.

Conflit d’intérêts

Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts concernant les données publiées dans cet article.

 
Acknowledgments

Nous remercions C. Bouche pour les Figures 2A et 2C,B. Delhomme pour les Figures 3A et 3B, et F. Daubigney pour l’élevage des souris. Ce travail a été soutenu par le Centre national de la recherche scientifique, l’université Paris Descartes et par des contrats de l’Association pour la recherche sur le cancer et de la Ligue contre le cancer.

 
Footnotes
1 On parle de métaplasie de Barrett lorsque l’épithélium malpighien normal constituant la muqueuse du bas œsophage est remplacé par un épithélium glandulaire de type intestinal, susceptible de dégénérer en un adénocarcinome.
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