Photo : adénosine (© Guillaume Lebon).

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de protéines membranaires. Chez l’homme, environ 800 gènes codent pour des RCPG [ 1]. Ces récepteurs, exprimés dans tous les organes du corps humain, sont impliqués dans les processus physiologiques importants et, par conséquent, dans les dysfonctionnements pathologiques de l’organisme. Ils représentent donc des cibles thérapeutiques très intéressantes pour le traitement des maladies cardiaques, des désordres inflammatoires ou du système nerveux central. Les RCPG ont de très nombreux ligands : des hormones, nucléotides, lipides, ions et neurotransmetteurs qui, en se fixant sur ces récepteurs, induisent un changement de leur conformation, permettant ainsi la transmission d’un signal extracellulaire vers l’intérieur de la cellule. L’activation des RCPG est alors convertie en signal cellulaire via l’activation des protéines G et d’autres effecteurs cellulaires comme les protéines arrestines [ 2, 3].

L’activité des RCPG est modulée par diverses catégories de ligands qui induisent et stabilisent différentes conformations du récepteur. Les agonistes activent le récepteur et le stabilisent préférentiellement dans une conformation active (R*) ; c’est le cas de l’adénosine pour le récepteur de l’adénosine. Les antagonistes limitent l’activité du récepteur à son activité basale, qui correspond à l’activité du récepteur en absence de stimulation par un agoniste. Un agoniste inverse, quant à lui, inactive totalement le récepteur et, ainsi, inhibe même son activité basale. Antagonistes et agonistes inverses stabilisent donc préférentiellement une conformation similaire, inactive, des récepteurs (R) [ 4].

Les RCPG interagissent avec différents partenaires intracellulaires tels que les protéines G ou les protéines arrestines. Chaque partenaire protéique va ainsi potentiellement stabiliser des conformations spécifiques du récepteur en interagissant avec le versant intracellulaire de ce dernier. Si l’on considère la grande diversité de ligands et de voies de signalisation qui peuvent être activées par un même récepteur, il apparaît évident que les RCPG sont des protéines très modulables pouvant adopter de multiples conformations [3]. Cette flexibilité peut être représentée par un large éventail d’états conformationnels définis par la fixation d’un ligand sur la surface extracellulaire du récepteur, mais aussi par l’interaction du récepteur avec des effecteurs cellulaires. Ces différents états conformationnels ont été étudiés par différentes approches telles que la mutagenèse dirigée, la modélisation moléculaire, ou encore les approches biophysiques. Cependant, la flexibilité conformationnelle des RCPG a longtemps limité leur analyse par des approches structurales telles que la cristallographie aux rayons X. De récents succès dans le domaine de la cristallisation des RCPG ont permis toutefois d’étudier la diversité structurale des RCPG de classe A et d’approfondir les connaissances sur leur mécanisme d’activation et de couplage aux protéines G [ 5– 7]. Ces nouvelles avancées ont aussi permis de caractériser au niveau moléculaire les conformations inactive R et active R*. Cette revue présente l’état des connaissances sur les structures cristallographiques des RCPG de classe A, avec un intérêt particulier pour les récepteurs β₁-adrénergique (β₁-AR) de la dinde, β₂-adrénergique (β₂-AR) humain et le récepteur de l’adénosine (A_2AR). En effet, l’analyse des structures des β₁-AR, β₂-AR et A_2AR, suggère la conservation d’un mécanisme d’activation commun pour ces trois récepteurs de classe A.

La première structure cristallographique d’un RCPG de classe A publiée est celle de la rhodopsine, une protéine activable par la lumière. La protéine rhodopsine est un modèle de référence pour l’étude structurale des RCPG. Les structures cristallographiques de haute résolution de la rhodopsine ont fait l’objet d’excellentes revues [ 6, 8] et ne seront que très brièvement mentionnées ici.

Depuis 2007, l’étude structurale par cristallographie aux rayons X des RCPG connaît un essor formidable. En effet, il a fallu attendre sept ans après la publication de la structure de la protéine rhodopsine, pour découvrir la première structure tridimensionnelle d’un RCPG liant une hormone, le β₂-AR [ 9]. Cette structure a été obtenue en utilisant un anticorps (Fab5) dirigé contre la 3^e boucle intracellulaire. La cristallogenèse des RCPG a longtemps été limitée par la difficulté à produire des cristaux de qualité diffractant à haute résolution [ 10]. En effet, l’extraction des récepteurs de la membrane cellulaire à l’aide de détergents est une étape délicate qui requiert l’utilisation de composés additifs (comme par exemple le cholestérol) pour améliorer la stabilité du récepteur et ainsi préserver sa structure tridimensionnelle [ 11, 43] (→). La flexibilité de la conformation des RCPG représente un obstacle supplémentaire pour l’obtention de cristaux de qualité.

(→) Voir la synthèse de J.L. Banères et B. Mouillac, page 837 de ce numéro

Différentes approches ont ainsi été développées afin de résoudre ces difficultés. Une première stratégie consiste à fusionner la protéine du lysozyme T4 (T4L) à l’extrémité intracellulaire des hélices 5 and 6, en remplacement de la boucle ICL3 (intracellular loop 3) (Figure 1) [ 12]. La protéine de fusion T4L permet d’augmenter la surface hydrophile du récepteur solubilisé à l’aide de détergents, tout en réduisant sa flexibilité et en favorisant ainsi la formation du cristal. Cette technique a permis de résoudre la structure haute résolution du récepteur β₂-AR humain lié à l’antagoniste carazolol [ 13] ou à divers antagonistes et agonistes inverses [11, 14]. Cette approche a ensuite été utilisée pour cristalliser et résoudre la structure tridimensionnelle du récepteur de l’adénosine (A_2A) [ 15], de la dopamine (D₃) [ 16], de l’histamine (H1) [ 17], le récepteur des chémokines CXCR4 (chemokine [C-X-C motif]receptor 4) [ 18], les récepteurs muscariniques M₂ et M₃ [ 19, 20], le récepteur des sphingosine-1-phosphate (S1P₁) [ 21] (Tableau I) et les récepteurs mu et delta des opiacés [ 42] (→), tous complexés à des antagonistes ou agonistes inverses, représentant ainsi une conformation inactive R. Une seconde stratégie, basée sur l’introduction de mutations ponctuelles et dirigées, permet d’améliorer dans le temps la stabilité du récepteur solubilisé : la thermostabilisation par mutagenèse dirigée [ 22– 25]. Cette approche a permis de résoudre la structure tridimensionnelle du β1-AR de la dinde lié à un antagoniste (cyanopindolol), et la structure du A_2AR lié à différents antagonistes (dont son antagoniste naturel, la caféine) (Figure 1) [ 26– 28].

(→) Voir aussi la synthèse de S. Granier, page 870 de ce numéro

Figure 1. Illustration des différentes stratégies utilisées pour l’étude cristallographique des RCPG. A. Structure du β1-AR thermostable de la dinde (2VT4) lié à l’antagoniste cyanopindolol (vert). Les mutations thermostabilisantes sont représentées en violet. B. Structure du β2-AR-T4L complexé à l’antagoniste carazolol (jaune) (2RH1). La protéine T4L (cyan) a été fusionnée aux extrémités intracellulaires des hélices 5 et 6. C. Structure du β2-AR-T4L lié à l’agoniste BI-167107 en complexe avec un anticorps de lama nb80 (bleu marine) (3POG). D. Structure du β2-AR-T4L lié à l’agoniste BI-167107 (jaune) en complexe avec la protéine G trimérique (α en rouge, β en jaune et γ en rose) (3NS6). L’anticorps de lama nb35 (violet) stabilise la sous-unité Gαs. La protéine de fusion T4L (cyan) a été introduite à l’extrémité amino-terminale du récepteur.

Figure 1. Illustration des différentes stratégies utilisées pour l’étude cristallographique des RCPG. A. Structure du β1-AR thermostable de la dinde (2VT4) lié à l’antagoniste cyanopindolol (vert). Les mutations thermostabilisantes sont représentées en violet. B. Structure du β2-AR-T4L complexé à l’antagoniste carazolol (jaune) (2RH1). La protéine T4L (cyan) a été fusionnée aux extrémités intracellulaires des hélices 5 et 6. C. Structure du β2-AR-T4L lié à l’agoniste BI-167107 en complexe avec un anticorps de lama nb80 (bleu marine) (3POG). D. Structure du β2-AR-T4L lié à l’agoniste BI-167107 (jaune) en complexe avec la protéine G trimérique (α en rouge, β en jaune et γ en rose) (3NS6). L’anticorps de lama nb35 (violet) stabilise la sous-unité Gαs. La protéine de fusion T4L (cyan) a été introduite à l’extrémité amino-terminale du récepteur.

La cristallisation d’un RCPG dans sa conformation active - lié à un agoniste - est plus difficile à obtenir que celle d’un RCPG dans sa conformation inactive. La conformation active des RCPG est énergétiquement plus instable et donc plus difficile à caractériser. L’année 2011 a cependant été riche en succès. La première conformation active (R*) du β₂-AR humain a été obtenue dans un premier temps à l’aide d’un anticorps de lama (nb80) (Figure 1) [29, 30]. Cet anticorps de lama a été sélectionné parce qu’il se lie au récepteur et mime la fixation de la protéine G. Dans le même temps, la structure tridimensionnelle du β₂-AR-T4L lié de manière covalente à un agoniste, FAUC50, et celle du β1-AR thermostable de la dinde lié à différents agonistes (tels que l’isoprénaline, un agoniste non sélectif des β-AR) ont été résolues [31, 32]. Il est à noter que la conformation active de la protéine rhodopsine, ainsi que la structure du mutant constitutivement actif E113Q, toutes deux publiées récemment, complètent les connaissances structurales de la conformation active de l’opsine¹ [ 33– 35]. C’est en utilisant la stratégie de thermostabilisation que nous avons pu résoudre la structure du A_2AR humain lié à son agoniste naturel (adénosine) [36, 37]. Dans le même temps, l’utilisation de la protéine de fusion T4L a permis de cocristalliser le A_2AR avec le ligand UK-432097, ligand développé pour le traitement de la bronchopneumopathie pulmonaire obstructive chronique [38]. Plus récemment, la structure du β₂-AR lié à la protéine G sous sa forme trimérique a été publiée, dévoilant ainsi la conformation active (R*) du β₂-AR (Figure 1) [39]. Cette dernière structure a été obtenue en utilisant à la fois la protéine de fusion T4L fusionnée à l’extrémité amino-terminale du récepteur et un anticorps de lama (nb35) qui réduit la flexibilité de la sous-unité α de la protéine G (Figure 1). Nous disposons maintenant de structures tridimensionnelles représentant différents états conformationnels des RCPG, inactifs R ou actifs R*. La comparaison de ces différentes structures révèle des similitudes et des différences au niveau des récepteurs de classe A.

La résolution des structures tridimensionnelles des RCPG confirme la prédiction d’une architecture commune, composée de sept hélices transmembranaires (TM1 à TM7) et d’une 8^e hélice (H8) positionnée parallèlement à la surface interne de la membrane plasmique. Seule la structure du récepteur CXCR4 est dépourvue de cette hélice supplémentaire [18]. Les 7 hélices transmembranaires sont reliées entre elles par trois boucles extracellulaires (ECL1, 2 et 3 reliant respectivement les TM2 et 3, TM4 et 5, TM6 et 7) et trois boucles intracellulaires (ICL1, 2 et 3 reliant respectivement les TM1 et 2, TM3 et 4, TM5 et 6). Les boucles intra- et extracellulaires sont de tailles différentes suivant les récepteurs et sont le reflet d’importantes variabilités structurales des RCPG, en particulier la boucle ECL2. Dans le cas de la rhodopsine, la boucle ECL2 forme un clapet qui se referme sur la poche de fixation du rétinal. Le long domaine amino-terminal complète cette organisation moléculaire et renforce la stabilité du complexe ainsi formé [ 40]. Le site de fixation est beaucoup plus exposé au solvant dans le cas du récepteur liant des ligands diffusibles. Dans le cas des récepteurs β₁-AR, β₂-AR et A_2AR, ECL2 se structure en une courte hélice a (environ deux tours d’hélice) et peut jouer des rôles différents. Pour les β₁-AR et β₂-AR, la boucle ECL2 participe à la formation du site de fixation du ligand, alors que pour l’A_2AR, le résidu F168 localisé dans cette boucle est indispensable à la fixation de l’adénosine, et donc à la fonctionnalité du récepteur [12, 31, 36].

Il existe une grande diversité dans les acides aminés qui composent la poche de fixation des ligands des RCPG. Cette diversité est le reflet du grand nombre de molécules, neurotransmetteurs ou hormones qui se lient spécifiquement à un seul type de récepteur, que ce soit un récepteur aminergique (β-AR, dopaminergique), nucléotidique (récepteur de l’adénosine) ou tout autre type de récepteur. Cependant, il est classique qu’entre sous-types de récepteurs qui répondent à un même ligand, comme par exemple les récepteurs de l’adénosine A₁, A_2A, A_2B et A₃, il existe un haut degré de conservation pour les résidus directement impliqués dans la fixation du ligand. Sur 16 résidus en contact direct avec l’adénosine dans la structure du A_2AR humain, 15 sont strictement conservés pour les sous-types A₁ et A_2B, et 10 pour le sous-type A₃ [36]. Il en est de même pour les β₁-AR et β₂-AR [7, 31]. La spécificité de fixation des ligands pour un sous-type impliquera davantage les résidus localisés dans les boucles extracellulaires, sources de la plus grande diversité entre les RCPG.

Afin d’activer la protéine G, la liaison d’un agoniste dans le site de fixation d’un RCPG induit des changements conformationnels correspondant aux mouvements des différents TM. Ces changements conformationnels sont de petite amplitude au niveau de la poche de fixation de l’agoniste, et c’est au niveau intracellulaire que l’on peut observer des modifications plus spectaculaires.

Nous disposons de multiples structures de RCPG liées à leur agoniste, comme par exemple le β₁-AR, β₂-AR, A_2AR ou encore la rhodopsine [6]. Les structures actives R* du β₂-AR, liées soit à un anticorps de lama (nb80), soit à la protéine trimérique Gs, sont considérées comme représentatives de la conformation active d’un RCPG [29, 39]. La présence de la protéine G ou de l’anticorps de lama (nb80) est indispensable à la stabilisation de la conformation active R*. La liaison de l’agoniste seul ne permet pas de stabiliser la conformation active R*. En effet, les structures du β₁-AR lié aux différents agonistes et du β₂-AR lié de manière covalente à un agoniste sont très similaires à la conformation inactive R. Les structures du A_2AR lié à l’adénosine ou encore au composé UK-432097 représentent des conformations très similaires à la conformation active R* du récepteur β₂-AR. Ces conformations ont été proposées comme représentatives d’un état intermédiaire entre les conformations inactive R et active R* [36]. Les différentes structures des β₁-AR, β₂-AR et A_2AR suggèrent des changements de conformation et un mécanisme d’activation conservés entre ces différents récepteurs, ainsi que l’existence d’une conformation active R* similaire. Par ailleurs, les β₁-AR, β₂-AR et A_2AR interagissent tous avec la même protéine Gs. Cependant, il est probable que les conformations actives des RCPG expriment un degré de variabilité afin de rendre compte de la diversité des protéines G pouvant interagir avec ces récepteurs.

Dans le cas des récepteurs de classe A (β₁-AR, β₂-AR et A_2AR), la fixation d’un agoniste induit la contraction de la poche de fixation du récepteur d’environ 1 Å [29, 31, 36]. Cette contraction représente la première étape de l’activation du récepteur. Les structures représentant les conformations R* des β₂-AR et A_2AR montrent que les extrémités intracellulaires des TM3 et TM7 et l’extrémité extracellulaire de TM5 sont repositionnées vers l’intérieur du récepteur (Figure 2) [29, 36]. Ces différents réarrangements locaux sont accompagnés d’un mouvement des extrémités intracellulaires des TM5 et TM6, notamment via une rotation de TM6, qui, en s’écartant du récepteur, ouvre ainsi une cavité dans laquelle l’extrémité carboxy-terminale de la sous-unité α de la protéine G vient s’arrimer (Figure 2). Le mouvement de l’hélice 6 est variable, allant de 5 Å dans le cas de la structure du A_2AR lié à l’adénosine, jusqu’à 14 Å pour la structure du β₂-AR lié à la protéine Gs [29, 36, 39]. Le mouvement de 5 Å de l’hélice 6 dans la structure du A_2AR lié à l’adénosine n’est cependant pas suffisant pour permettre l’arrimage de la protéine G, qui est nécessaire à la stabilisation de la conformation active R*. La publication de la structure du β₂-AR complexé à la protéine trimérique Gs (α, β et γ) nous montre que le domaine Ras de la sous-unité Gα (Gα_Ras) est principalement responsable de l’interaction entre le β₂-AR et la protéine G [39]. L’hélice α5 de la sous-unité alpha de la protéine Gs interagit avec le β₂-AR au niveau de l’arginine R3.50 (TM3) du motif conservé E/DRY. Cette interaction est stabilisée par la tyrosine Y7.53 (TM7) appartenant au motif NPxxY, confirmant ainsi l’importance de ces deux motifs conservés (E/DRY et NPxxY) pour le couplage des RCPG avec la protéine Gs [39, 41].

Figure 2. Conformation active R* du récepteur β 2-AR humain. A. Superposition de la structure inactive R (β2-AR lié à l’antagoniste carazolol [2HR1]) et de la conformation active R* (β2-AR complexé à l’agoniste BI-167107 et à la protéine trimérique Gs [3NS6]). Le repositionnement de l’hélice 6 ouvre une cavité dans laquelle la sous-unité Gαs s’arrime. B. Vue de la surface intracellulaire du β2-AR. Le TM5, et surtout le TM6, sont repositionnées vers l’extérieur du récepteur, alors que le TM3 et le TM7 se déplacent vers l’intérieur du récepteur. C. Vue de la surface extracellulaire du β2-AR. Le repositionnement du TM5 vers l’intérieur du récepteur s’effectue au niveau du site de fixation de l’agoniste BI-167107.

Figure 2. Conformation active R* du récepteur β 2-AR humain. A. Superposition de la structure inactive R (β2-AR lié à l’antagoniste carazolol [2HR1]) et de la conformation active R* (β2-AR complexé à l’agoniste BI-167107 et à la protéine trimérique Gs [3NS6]). Le repositionnement de l’hélice 6 ouvre une cavité dans laquelle la sous-unité Gαs s’arrime. B. Vue de la surface intracellulaire du β2-AR. Le TM5, et surtout le TM6, sont repositionnées vers l’extérieur du récepteur, alors que le TM3 et le TM7 se déplacent vers l’intérieur du récepteur. C. Vue de la surface extracellulaire du β2-AR. Le repositionnement du TM5 vers l’intérieur du récepteur s’effectue au niveau du site de fixation de l’agoniste BI-167107.

Enfin, pour activer le β₂-AR, le ligand BI-167107 établit des interactions au niveau des résidus sérines 203 (S5.42) et 207 (S5.46) localisés dans le TM5 du β₂-AR [29]. Il en est de même pour l’isoprénaline, agoniste non spécifique du β-AR, qui active le β₁-AR de la dinde en établissant des liaisons hydrogène avec les résidus sérine 211 (S5.42) et 215 (S5.46) [31]. L’adénosine va, quant à elle, établir des liaisons spécifiques impliquant la sérine 277 (S7.42) et l’histidine 278 (H7.43) localisées dans le TM7 du A_2AR [36]. Il est intéressant de constater que deux agonistes, BI-167107 pour le β₂-AR et l’adénosine pour le A_2AR, interagissent avec le récepteur via des contacts qui leur sont spécifiques et différents. Ils induiront in fine des changements conformationnels similaires proposés comme caractéristiques de la conformation active R* des β₂-AR et A_2AR, et surtout considérés comme nécessaires à la stabilisation de la conformation active R*.

Les études structurales des RCPG par cristallographie aux rayons X ont permis d’approfondir les connaissances sur cette catégorie de récepteurs (en élucidant les modes de fixation des ligands sur les différents types de récepteurs), d’identifier des signatures moléculaires des conformations inactives R et actives R*, et de révéler la diversité structurale de cette classe de protéines membranaires importantes. Ces informations structurales devraient permettre de développer des composés sélectifs d’un type de récepteur et de moduler son activité en fonction des besoins et de l’intérêt thérapeutique du récepteur ciblé. Il est cependant évident que d’autres techniques, comme la résonnance magnétique nucléaire ou encore les expériences de simulation de la dynamique moléculaire in silico, permettront d’approfondir les connaissances et la compréhension des complexes de signalisation formés par les RCPG avec les différents effecteurs cellulaires, comme les protéines G et les arrestines. L’ère de la biologie structurale des RCPG vient de débuter.

Les auteurs déclarent n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article.