Un adulte en bonne santé produit jusqu’à cent milliards de nouveaux globules rouges chaque jour, afin d’en maintenir les stocks sanguins. Le globule rouge, ou érythrocyte, contient l’hémoglobine responsable de transporter l’oxygène des poumons vers l’ensemble du corps. L’érythrocyte a son origine dans la moelle osseuse, dérivant de la cellule souche hématopoïétique via un processus complexe de prolifération et de différenciation [ 1, 2]. Il reste encore beaucoup à apprendre sur les mécanismes moléculaires de ces événements, non seulement pour comprendre la cause de certains troubles hématologiques, mais aussi pour envisager un jour la production de globules rouges en laboratoire – un enjeu important pour la transfusion.

Les génomes des vertébrés supérieurs codent pour des centaines de protéines à doigt de zinc dotées d’un domaine KRAB (KRAB-ZFP). Ces protéines reconnaissent des séquences spécifiques de l’ADN via leurs doigts de zinc, et y recrutent leur cofacteur universel KAP1 via le motif KRAB (Krueppel-associated box). KAP1, également connu sous les noms de TRIM28 (protéine à motif tripartite 28), TIF1β (facteur de transcription intermédiaire 1β), ou Krip-1 (KRAB-interacting protein 1), agit ensuite comme une plate-forme pour un complexe multimoléculaire qui réprime la transcription par l’induction d’hétérochromatine [ 3, 4]. Le système KRAB/KAP1 a probablement d’abord évolué pour minimiser les perturbations du génome induites par l’invasion des rétroéléments [ 5], mais des données récentes indiquent qu’il contrôle également de multiples aspects de la physiologie des mammifères [ 6, 7].

Afin d’étudier le rôle potentiel de ce système dans l’hématopoïèse, nous avons construit une souris adulte dont le gène codant pour KAP1 est invalidé sélectivement (knock-out, KO) dans les lignées hématopoïétiques. Le phénotype de ces souris se caractérise par une série d’anomalies hématologiques dont la plus remarquable est une anémie due à un arrêt de différenciation des précurseurs des érythrocytes - les érythroblastes - au stade où ils expriment fortement les marqueurs de surface CD71 (le récepteur de la transferrine) et Ter119 (marqueur associé à la glycophorine A chez la souris) (Figure 1A).

Figure 1. Phénotype des érythroblastes KAP1 KO : arrêt de maturation et accumulation des mitochondries. A. Analyse par FACS (fluorescence-activated cell sorting) des cellules exprimant les marqueurs de surface CD71 et Ter119, issues de la moelle osseuse des souris contrôles (Ctrl) ou de souris dont le gène KAP1 a été invalidé dans les lignées hématopoïétiques (KO). Le pourcentage de chaque population dans la moelle totale est indiqué sur le graphique. B. Microscopie électronique des cellules CD71+Ter119+ contrôles et KAP1 KO. Panneau de gauche : les étoiles indiquent les mitochondries observées ; panneau du milieu : nombre moyen de mitochondries mesuré par cellule (n = 10, *p < 0,05) ; panneau de droite : résultats obtenus avec la coloration MitoTracker (n = 4, *p < 0,05).

Figure 1. Phénotype des érythroblastes KAP1 KO : arrêt de maturation et accumulation des mitochondries. A. Analyse par FACS (fluorescence-activated cell sorting) des cellules exprimant les marqueurs de surface CD71 et Ter119, issues de la moelle osseuse des souris contrôles (Ctrl) ou de souris dont le gène KAP1 a été invalidé dans les lignées hématopoïétiques (KO). Le pourcentage de chaque population dans la moelle totale est indiqué sur le graphique. B. Microscopie électronique des cellules CD71+Ter119+ contrôles et KAP1 KO. Panneau de gauche : les étoiles indiquent les mitochondries observées ; panneau du milieu : nombre moyen de mitochondries mesuré par cellule (n = 10, *p < 0,05) ; panneau de droite : résultats obtenus avec la coloration MitoTracker (n = 4, *p < 0,05).

L’examen de ces érythroblastes dépourvus de KAP1 en microscopie électronique et par une technique de coloration spécifique (MitoTracker) a révélé qu’ils contenaient plus de mitochondries que les contrôles (Figure 1B). En corollaire de cette observation, l’analyse de l’expression des gènes a montré dans ces cellules une diminution des transcrits (comme ceux de BNIP3L, ULK1 [unc-51 like autophagy activating kinase 1], Gabarapl2 [GABA(A) receptor-associated protein-like 2], Sh3glb1 [SH3-domain GRB2-like endophilin B1], Atg12 [autophagy related 12], Becn1 [beclin 1] et BCL2L1) impliqués dans la mitophagie, mécanisme d’élimination des mitochondries (Figure 2A). Cette dernière représente une étape importante dans le processus de différenciation des globules rouges.

Figure 2. Une cascade impliquant des KRAB-ZFP spécifiques des érythroblastes, le microARN-351 et le gène BNIP3L contrôle la mitophagie dans les globules rouges. A. Expression des gènes impliqués dans la mitophagie dans les érythroblastes contrôles (Ctrl) et KAP1 KO (n = 4, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). En dessous du graphique est indiquée l’expression des microARN dans les mêmes échantillons, la croix (X) désignant leurs cibles potentielles prédites. B. Le microARN351 cible directement la région terminale non codante du gène BNIP3L. C. Analyse par FACS des globules rouges de la moelle osseuse de souris greffées avec des cellules souches hématopoïétiques modifiées génétiquement par un vecteur lentiviral permettant l’extinction de l’expression de ZFP689 ou 13. Le contrôle (Ctrl) correspond à l’utilisation d’un vecteur vide ou ne ciblant aucun gène. Pour chaque condition, l’expression du microARN351 (D) et du gène BNIP3L (E) dans les cellules CD71+Ter119+ a été mesurée (n = 6, *p < 0,05).

Figure 2. Une cascade impliquant des KRAB-ZFP spécifiques des érythroblastes, le microARN-351 et le gène BNIP3L contrôle la mitophagie dans les globules rouges. A. Expression des gènes impliqués dans la mitophagie dans les érythroblastes contrôles (Ctrl) et KAP1 KO (n = 4, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). En dessous du graphique est indiquée l’expression des microARN dans les mêmes échantillons, la croix (X) désignant leurs cibles potentielles prédites. B. Le microARN351 cible directement la région terminale non codante du gène BNIP3L. C. Analyse par FACS des globules rouges de la moelle osseuse de souris greffées avec des cellules souches hématopoïétiques modifiées génétiquement par un vecteur lentiviral permettant l’extinction de l’expression de ZFP689 ou 13. Le contrôle (Ctrl) correspond à l’utilisation d’un vecteur vide ou ne ciblant aucun gène. Pour chaque condition, l’expression du microARN351 (D) et du gène BNIP3L (E) dans les cellules CD71+Ter119+ a été mesurée (n = 6, *p < 0,05).

Ces résultats révèlent l’existence d’un système de régulation de la transcription où protéines et ARN se superposent en une combinatoire subtile pour que soit déclenchée au moment opportun une étape clé de l’érythropoïèse. Dans ce processus, plusieurs protéines KRAB-ZFP sont impliquées dans le contrôle de plusieurs microARN, eux-mêmes ayant pour cibles plusieurs transcrits de gènes associés avec la mitophagie ou d’autres événements intervenant lors de la maturation érythrocytaire. Cette apparente redondance - ou plutôt addition - d’effets parallèles ciblant le même processus physiologique a déjà été relevée dans le domaine de l’interférence ARN [ 10]. La découverte que ce dernier puisse lui-même être modulé par le système des KRAB-ZFP, qui agissent également de façon multifactorielle, ajoute un remarquable degré de modularité et de robustesse à ce type de régulation.

Les auteurs déclarent n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article.

L'auteur remercie Franck Aguila pour ses conseils artistiques sur les figures, Thomas Lorivel et Joëlle Chabry pour leur relecture attentive, Audrey Recouly, Fabienne Chevallier et Florence Servent de la Société CISBIO Bioassays, Codolet, France pour les expériences en FRET utilisant la technologie Tag-lite et Richard Miller (Chicago) pour nous avoir fourni le clone de CXCR4.