• Les ASO sont des petites séquences synthétiques d’ADN simple brin de 12 à 25 nucléotides reconnaissant et liant un ARNm afin de moduler sa fonction (Figure 1A) [9]. Après hybridation de l’ASO, une enzyme endogène, la RNAse H, induit le clivage du complexe ADN-ARN, et entraîne une dégradation de l’ensemble de l’ARNm. Des modifications chimiques ont été apportées aux ASO afin d’augmenter leur demi-vie, et donc leur efficacité [10]. Des modifications de la structure du squelette ou des sucres présents dans les nucléotides ont été testées. En particulier, les modifications de squelette permettent d’augmenter la résistance des ASO aux nucléases cellulaires, alors que les modifications au niveau des sucres améliorent l’affinité du brin d’ADN pour l’ARNm cible. Cependant, ces changements peuvent induire une résistance de l’ASO à la RNAse H et, donc, modifier l’efficacité d’inactivation.

  Figure 1. Mécanismes d’action des ASO, des siARN et des shARN. A. Les ASO pénètrent dans la cellule grâce à la semi-perméabilité de la membrane plasmique. Une fois dans le cytoplasme, ils s’hybrident sur l’ARNm cible, ce qui active la RNAse H endogène et permet la dégradation de l’ARNm. B. L’entrée des siARN simple- ou double-brins dans la cellule se fait de la même façon que celle des ASO. Dans le cytoplasme, ils sont incorporés dans le complexe RISC et peuvent alors reconnaître l’ARNm cible. La dégradation de l’ARNm est alors produite grâce au RISC. C. L’entrée des shARN seuls ou inclus dans un miARN (miARN-shARN) se fait par l’interaction du vecteur viral avec son récepteur à la surface de la membrane plasmique. Le matériel génétique est alors transféré dans le noyau où il est transcrit. Dans le cadre des shARN, la tige-boucle transcrite est exportée vers le cytoplasme, où elle est clivée par l’enzyme Dicer. Une séquence double-brin contenant les 20 nucléotides complémentaires de l’ARNm cible est libérée et incorporée dans le complexe RISC, qui libère alors le brin passager pour ne conserver que la séquence complémentaire de l’ARNm cible. L’ARNm est dégradé par RISC après l’hybridation du shARN. La maturation cytoplasmique des miARN-shARN reste la même ; cependant, une étape supplémentaire a lieu dans le noyau. Après la transcription, le miARN-shARN est clivé par l’enzyme Drosha pour libérer un pré-miARN, qui est exporté vers le cytoplasme.

  Figure 1. Mécanismes d’action des ASO, des siARN et des shARN. A. Les ASO pénètrent dans la cellule grâce à la semi-perméabilité de la membrane plasmique. Une fois dans le cytoplasme, ils s’hybrident sur l’ARNm cible, ce qui active la RNAse H endogène et permet la dégradation de l’ARNm. B. L’entrée des siARN simple- ou double-brins dans la cellule se fait de la même façon que celle des ASO. Dans le cytoplasme, ils sont incorporés dans le complexe RISC et peuvent alors reconnaître l’ARNm cible. La dégradation de l’ARNm est alors produite grâce au RISC. C. L’entrée des shARN seuls ou inclus dans un miARN (miARN-shARN) se fait par l’interaction du vecteur viral avec son récepteur à la surface de la membrane plasmique. Le matériel génétique est alors transféré dans le noyau où il est transcrit. Dans le cadre des shARN, la tige-boucle transcrite est exportée vers le cytoplasme, où elle est clivée par l’enzyme Dicer. Une séquence double-brin contenant les 20 nucléotides complémentaires de l’ARNm cible est libérée et incorporée dans le complexe RISC, qui libère alors le brin passager pour ne conserver que la séquence complémentaire de l’ARNm cible. L’ARNm est dégradé par RISC après l’hybridation du shARN. La maturation cytoplasmique des miARN-shARN reste la même ; cependant, une étape supplémentaire a lieu dans le noyau. Après la transcription, le miARN-shARN est clivé par l’enzyme Drosha pour libérer un pré-miARN, qui est exporté vers le cytoplasme.

• Par opposition aux ASO, l’ARN interférence (ARNi) utilise d’autres mécanismes pour induire le silencing d’un gène. L’ARNi a été initialement découverte chez le pétunia en 1986. Ce n’est qu’au début des années 2000 que Craig Melo et Andrew Fire ont démontré l’existence d’ARNi chez les mammifères ; ils ont reçu le prix Nobel de physiologie et de médecine en 2006 pour cette découverte [41]. L’intérêt thérapeutique des petits ARN interférents a été rapidement reconnu et démontré avec les siARN et les shARN.

Les siARN sont des petites séquences d’ARN simple ou double brin d’environ 19-21 nucléotides ayant une action proche de celle des microARN (Figure 1B) [11]. Après leur introduction dans le cytoplasme de la cellule, les siARN sont reconnus par le complexe RISC (RNA-induced silencing complex) de la machinerie des microARN, s’hybrident sur l’ARNm mature du gène cible et induisent son clivage [42]. Tout comme les ASO, des modifications chimiques des séquences de nucléotides ont été testées afin d’augmenter la stabilité des molécules sans modifier leur mécanisme d’action. Cependant, l’administration des ASO/siARN dans le système nerveux central représente un défi majeur de par la présence de la barrière hémato-encéphalique (BHE) [38] et de la membrane plasmique des cellules. De plus, pour maintenir le bénéfice thérapeutique dans une pathologie progressive comme la maladie de Huntington, des injections répétées seraient nécessaires.

Afin d’obtenir une expression continue, des systèmes basés sur des shARN artificiels ont été développés. Dans ce cas, la cellule cible produit elle-même le shARN thérapeutique. Ce dernier est synthétisé sous la forme d’une « tige-boucle » constitutivement exprimée par la cellule (Figure 1C) [12]. Pour cela, le shARN est transféré dans la cellule cible avec toutes les séquences nécessaires et, en particulier, un promoteur eucaryote permettant une expression stable et continue de la molécule. Le shARN est ensuite reconnu par la machinerie cellulaire (endoribonucléase Dicer) et le complexe RISC qui incorpore la séquence de 20 nucléotides complémentaire de celle de l’ARNm cible. Récemment, des shARN ont été incorporés dans le « squelette » d’un miARN afin de tirer parti de cette voie de synthèse et, ainsi, de permettre une maturation plus physiologique du shARN [13]

Comme mentionné précédemment, l’administration d’ASO ou de si/shARN dans le cerveau représente un obstacle important au développement d’un traitement pour la maladie de Huntington. L’injection de matériel génétique en périphérie, par voie intraveineuse par exemple, nécessite l’utilisation de très hautes doses de molécules. De plus, ce procédé ne permet pas de sélectionner la zone cérébrale à traiter. Afin de contourner la barrière hémato-encéphalique [38] et d’améliorer la diffusion dans le système nerveux central, le matériel génétique peut être injecté directement dans la structure cérébrale à traiter (voie intraparenchymateuse) ou dans les ventricules cérébraux (voie intracérébroventriculaire, ICV). Dans le cas des ASO et des siARN, qui ne nécessitent pas de vecteurs d’expression, la solution la plus simple consiste à injecter la séquence génétique directement dans le cerveau. Grâce à la semi-perméabilité de la membrane plasmique, une quantité significative de matériel génétique est transférée dans la cellule cible. Afin d’augmenter la quantité d’ADN/ARN incorporée dans la cellule, les acides nucléiques peuvent être couplés à des composés chimiques pénétrant naturellement dans le cytoplasme, comme des liposomes ou le cholestérol, ce qui augmente la quantité de matériel transféré dans la cellule [14, 15].

Dans le cas des shARN, la séquence génétique doit être intégrée dans un vecteur d’expression permettant la transcription du shARN. Ce vecteur doit être transféré dans le noyau cellulaire, siège de l’expression des gènes. Des approches dites « virales » sont privilégiées pour le transfert des shARN dans le cerveau. Les virus ont la capacité naturelle de transférer du matériel génétique dans un vaste éventail de types cellulaires, indépendamment de l’espèce, de l’âge et du stade de développement [16] (Encadré 1). Parmi ceux-ci, les vecteurs dérivés des virus adéno-associés (AAV), des adénovirus (Ad) ou des lentivirus (LV) présentent un fort taux de transduction dans le cerveau et sont utilisés depuis plusieurs années pour le transfert de gènes [17].

Une des premières utilisations du gene silencing pour la maladie de Huntington a été décrite en 2005 (Figure 2) [14]. Un siARN ciblant l’ARNm de la mHTT humaine a été injecté par voie intracérébroventriculaire dans des souris transgéniques modèles de la maladie peu de temps après leur naissance. Une baisse de l’expression de la mHTT a été observée jusqu’à huit semaines, ainsi qu’une diminution du nombre d’agrégats de mHTT, une amélioration motrice et une extension de la durée de vie des souris [19]. Cette première preuve de principe a montré l’intérêt de l’approche, même si le traitement était transitoire. D’autres travaux, basés sur l’injection d’ASO ou de siARN visant la mHTT chez la souris adulte, ont confirmé l’intérêt du silencing dans cette indication [9, 15]. Une seule administration d’ASO en intracérébroventriculaire assure une large distribution dans le cerveau, et un silencing qui atteint plus de 60 % du taux de mHTT dans certaines régions. L’expression de la HTT retrouve son niveau basal 16 semaines après l’administration, mais les effets thérapeutiques persistent durant cinq mois. Ceci révèle qu’une baisse transitoire de l’expression de la mHTT induit des effets bénéfiques à moyen terme. Cependant, il a été observé que les molécules diffusent moins bien dans les couches profondes du cerveau, dont le striatum, après une injection par voie intracérébroventriculaire [20, 21]

Des résultats similaires ont été obtenus avec des vecteurs AAV exprimant un shARN ou un miARN-shARN. Une réduction de l’expression de la mHTT dès les premières semaines post-infection a été observée dans le striatum de différents modèles animaux de la maladie [15, 22–27]. Cependant, contrairement aux approches basées sur les siARN et les ASO, l’intégration des shARN dans des vecteurs permet d’obtenir une expression constitutive et stable dans le temps, avec un blocage de l’expression de la mHTT et des effets thérapeutiques persistant jusqu’à neuf mois post-infection [27]. De plus, ces études ont montré qu’une baisse partielle de l’expression de la HTT saine ne semble pas induire d’effets délétères, et qu’un silencing partiel de la mHTT est suffisant pour procurer des effets thérapeutiques. La biosécurité et la tolérance d’un silencing partiel de l’HTT restent à démontrer, mais les premiers résultats chez le primate non humain montrent que cette approche est envisageable chez l’homme [28].

La grande similitude de séquence entre l’allèle sain et muté de la HTT limite considérablement les options permettant de discriminer les deux allèles. Cependant, des siARN et des ASO reconnaissant sélectivement les longues répétitions CAG ont été synthétisés (Figure 2) [11, 18]. Certaines de ces molécules permettent de discriminer les deux allèles de la HTT tout en conservant une bonne efficacité thérapeutique. Il a été observé que la sélectivité pour l’allèle muté diminue pour les formes les plus communément observées (40-45 CAG) du fait du nombre moins important de triplets [9]. De plus, ces molécules sont potentiellement capables de reconnaître les ARNm d’autres gènes contenant des expansions CAG (comme les transcrits de l’ataxine 1 ou de l’atrophine 1), ce qui pourrait induire des effets secondaires. Une autre stratégie pour obtenir un silencing sélectif de la mHTT est basée sur la présence de SNP dans le gène HTT (Figure 2). Ils sont au nombre d’environ 2 000 pour ce gène, dont certains ont une haute fréquence d’hétérozygotie et permettraient de traiter 75-88 % des patients si 3-5 SNP étaient ciblés [29–31]. Dès lors, ces SNP peuvent être utilisés pour introduire des non-homologies de séquences (mismatches) entre l’ASO/siARN/shARN et l’allèle HTT sain, ce qui prévient la dégradation de l’ARNm de l’allèle sain. Des ASO et des siARN chimiquement modifiés visant ces SNP permettent de baisser de 39 à 68 % l’expression de la mHTT en ayant un impact minimal sur l’allèle sain. Ces ASO et siARN spécifiques des allèles sont actuellement testés dans des études précliniques [9, 11, 32]. L’application de cette même stratégie avec un lentivirus exprimant un shARN ciblant sélectivement la mHTT humaine permet de réduire l’expression de la protéine mutée in vivo de près de 40-70 % dans un modèle animal de la maladie [33]. Une diminution des marqueurs de la pathologie a été observée consécutivement au traitement, et des améliorations fonctionnelles, dont une normalisation du trafic vésiculaire, ont été démontrées à la fois dans des modèles animaux et dans des cellules de patients. Ces premières données mettent en évidence la faisabilité, l’efficacité et la sélectivité d’un silencing de la mHTT. Cependant, ces approches nécessitent de génotyper les patients afin d’identifier les SNP qui leur sont spécifiques et de développer les produits couvrant l’ensemble de ces SNP.

La principale difficulté d’une stratégie thérapeutique basée sur le gene silencing reste la spécificité du traitement. Trois types d’effets indésirables peuvent survenir : la présence d’effets hors cibles (off-targets effects), la saturation de la machinerie cellulaire et la mise en place de réponses immunitaires/inflammatoires contre la séquence nucléique (Figure 3).

• Il est important de contrôler la présence d’effets hors cibles, c’est-à-dire le silencing d’ARNm présentant une homologie partielle avec le shARN-HTT, ce qui induirait une hybridation partielle ou complète de la molécule thérapeutique avec ces ARNm. Des modèles mathématiques permettent d’estimer la probabilité de cibles indésirables d’une séquence nucléique [34]. Cependant, une potentielle homologie de séquence mise en évidence par ces algorithmes ne se traduit pas forcément par le silencing du gène dans une cellule. De plus, ces effets hors cibles sont dépendants de la séquence et de l’espèce ; des études précliniques dans des modèles proches de l’humain sont nécessaires pour réduire leur probabilité d’apparition.
• Une trop forte dose d’un ASO/siARN/shARN peut également conduire à la saturation de la machinerie cellulaire, induisant une forte toxicité [35].
• Enfin, la présence dans la cellule de matériel génétique étranger peut induire une réponse inflammatoire ou immunitaire. Cela a déjà été observé dans les organes périphériques, mais reste peu présent dans le système nerveux central du fait de la protection du cerveau par la barrière hémato-encéphalique [36]. Cependant, une quantité anormale de matériel génétique dans le cerveau peut conduire à l’expression par les neurones de protéines reconnues par le système immunitaire, et donc à une destruction des cellules traitées par l’organisme [37]. Il est donc primordial de bien contrôler ces paramètres, in vitro dans des cellules humaines, et in vivo dans des modèles primates, plus proches de l’homme, pour ces aspects de spécificité de séquence et de réponse de l’organisme au produit thérapeutique.