Vignette (Pithovirus © Jean-Michel Claverie).

La notion paradoxale de « virus géants » date de 2003, quand la nature « virale » du Mimivirus a été finalement reconnue [1], plus de 10 années après son isolement et sa classification initiale comme une bactérie parasite intracellulaire obligatoire des amibes du genre Acanthamoeba [2]. Par la taille de ses virions (d’un diamètre d’environ 750 nm), le Mimivirus représentait la première violation du critère historique de la « bougie de Chamberland » qui avait mené à la découverte du premier virus par Ivanoski en 1898 [3] et s’appliquait depuis à tous les virus : leur capacité à passer à travers des filtres de stérilisation (de porosité 0,2 µm) retenant la plupart des bactéries et, par conséquent, leur invisibilité en microscopie optique. Fidèle à cette tradition, notre laboratoire ne qualifie de géants que les virus dont les particules sont suffisamment grandes pour être facilement dénombrables en lumière visible. Comme les premiers virus dotés de particules « géantes » avaient également des génomes de grandes tailles (plus d’un million de paires de bases pour les premiers Mimiviridae), ce dernier critère a souvent été utilisé à la place du critère de visibilité optique. Or nous savons maintenant que la corrélation entre la taille des virions et celle des génomes qu’ils transportent est loin d’être absolue. L’existence de virus à grands génomes (i.e. > 300 kilobases [kb]), mais dont les virions restent sous la limite de la visibilité optique, est maintenant source d’inconsistances dans la littérature, dans laquelle ces virus sont parfois répertoriés comme « géants ». Dans cette revue, nous resterons fidèles au critère historique. Nous ne présenterons en détails que les virus dont les particules « géantes » sont clairement visibles en microscopie optique. Ces virus correspondent aujourd’hui à 4 familles distinctes dont les prototypes sont Mimivirus [4], Pandoravirus salinus [5], Pithovirus sibericum [6] et Mollivirus sibericum ² [7] (Figure 1). Nous ne parlerons pas de deux autres familles qui sont à la limite du critère de visibilité pour lesquelles les prototypes sont Marseillevirus [8], dont les membres infectent le même hôte cellulaire que les quatre précédentes, et Faustovirus qui infecte une autre amibe du genre Vermamoeba [9] (Tableau I).

Figure 1. Morphologie des particules. 1. Vues en microscopie optique (x63, Nomarski). La barre d’échelle mesure 2 µm. 2. Vues en microscopie électronique à balayage. La barre d’échelle mesure 100 nm. 3. Vues en coupe fine par microscopie électronique en transmission. A : Mimivirus. B : Mollivirus. C : Pandoravirus. D : Pithovirus.

Figure 1. Morphologie des particules. 1. Vues en microscopie optique (x63, Nomarski). La barre d’échelle mesure 2 µm. 2. Vues en microscopie électronique à balayage. La barre d’échelle mesure 100 nm. 3. Vues en coupe fine par microscopie électronique en transmission. A : Mimivirus. B : Mollivirus. C : Pandoravirus. D : Pithovirus.

D’abord retardée par le paradigme construit au cours du premier siècle de la virologie consacré – par définition – aux virus dits « filtrants », la découverte du premier virus géant, Mimivirus, n’a constitué que la première étape d’une aventure scientifique encore plus étonnante dans laquelle nous sommes encore plongés : les virus géants non seulement existent, mais nous savons maintenant qu’ils sont ubiquitaires, abondants, et se répartissent dans une diversité de familles dont nous avons probablement à peine commencé l’inventaire. La famille des Mimiviridae (ou des Megaviridae, tels qu’ils sont quelquefois dénommés, en référence à leur génome de plus d’une mégabase) s’est progressivement dessinée à partir de l’exploration systématique de multiples environnements, dans le but initial de mieux cerner les propriétés et les contours de ce que l’on pensait n’être qu’une famille unique de « monstres de foire » apparentés à Mimivirus. Dans cette recherche, les premiers travaux de métagénomique ont joué un rôle important puisque ce sont eux qui nous ont d’abord guidé vers l’exploration de l’environnement marin [10] qui a mené à l’identification, sur les côtes chiliennes, du plus grand Mimiviridae connu à ce jour, Megavirus chilensis [11]. En parallèle, les travaux de virologues/océanographes s’intéressant spécifiquement à la dynamique des efflorescences de protozoaires planctoniques ont révélé l’existence d’une branche divergente de Mimiviridae marins de plus petite taille (aux génomes néanmoins respectables de plus de 450 000 paires de bases) mais qui semblent jouer un rôle majeur dans la régulation des populations planctoniques [12]. Ces virus n’infectent pas l’amibe Acanthamoeba, mais des eucaryotes unicellulaires tels que Cafeteria roenbergensis (CroV) [13], Phaeocystis globosa (PgV) [14], Haptolina ericina (CeV) [15], ou Aureococcus anophagefferens (AaV) [16] (Figure 2). Ces protozoaires appartiennent à différentes divisions au sein du groupe phylogénétique des Bikonts (i.e. des cellules à deux flagelles) dont la divergence avec les amibes (appartenant au groupe des Unikonts, cellules à un seul flagelle) précède la radiation du domaine eucaryote. Une telle distribution d’hôte suggère immanquablement que l’origine des Mimiviridae pourrait avoir précédé cette radiation et donc être contemporaine de l’émergence du domaine eucaryote [17] (Figure 2), une hypothèse qui est encore loin de faire l’unanimité [18] même si elle correspond au scénario évolutif le plus parcimonieux. Une origine aussi ancienne prédit que des virus de la famille des Mimiviridae auraient pu (ou pourraient) infecter des hôtes cellulaires appartenant à la lignée des Opisthokonts (qui inclut les métazoaires et les champignons) ou des plantes. Aucun exemple de cette sorte n’a pour l’instant été documenté, mais de très anciennes infections semblent avoir laissé des traces dans les génomes d’espèces appartenant à ces groupes [19] (comme au sein des cnidaires, un des plus anciens phylums du règne animal [20]) (voir Encadré).

Figure 2. Diversité des hôtes eucaryotes connus pour être infectés par des Mimiviridae. Les noms des virus dont les génomes sont entièrement séquencés sont écrits en jaune, les génomes partiels en blanc. Mb : mégabase ; kb : kilobase (d’après [17]).

Figure 2. Diversité des hôtes eucaryotes connus pour être infectés par des Mimiviridae. Les noms des virus dont les génomes sont entièrement séquencés sont écrits en jaune, les génomes partiels en blanc. Mb : mégabase ; kb : kilobase (d’après [17]).

À la suite de la découverte de la nature virale de Mimivirus, près de 10 années de recherche d’autres virus géants réalisée par co-culture de multiples échantillons environnementaux avec Acanthamoeba n’ont étonnamment livré que de nouveaux membres de la famille des Mimiviridae. Tous partagent la même structure caractéristique de leur virion : une couche externe constituée d’un matériau fibrillaire entourant une capside protéique pseudo-icosaédrique d’environ 0,5 µm de diamètre contenant elle-même deux membranes lipidiques entourant un « noyau » dense aux électrons. Ils partagent un génome d’ADN linéaire riche en adénine-thymine (AT > 70 %) avec des tailles allant jusqu’à 1,26 million de paires de bases codant jusqu’à 1 120 protéines [11]. Si cette quête a progressivement permis d’établir l’existence de trois sous-groupes proches mais néanmoins distincts (A : prototype Mimivirus, B : prototype Megavirus chilensis, C : prototype Moumouvirus), elle a failli nous faire croire que les seuls virus géants à découvrir n’appartiendraient qu’à une seule et même famille, suggérant par là même leur statut d’aberration évolutive et de monstre de foire³ [46, 47] (→).

(→) Voir la Nouvelle de M. Bekliz et al., m/s n° 10, octobre 2016, page 818

C’est dans ce contexte qu’est survenue la découverte quasiment simultanée de deux nouveaux virus géants dont l’analyse génomique a démontré qu’ils n’avaient aucune parenté phylogénétique avec les Mimiviridae. D’abord nommés, en interne, « nouvelle forme de vie », en raison de leurs dimensions (plus d’un micron de long), de leur morphologie (une sorte d’amphore), et de leurs propriétés (multiplication sans division apparente), ces deux nouveaux virus [5] ont été publiés sous les noms de Pandoravirus salinus (isolé des côtes chiliennes) et Pandoravirus dulcis (isolé d’un étang au beau milieu de l’université La Trobe, près de Melbourne). Ils représentaient les premiers exemplaires de la famille des Pandoraviridae qui se peuple maintenant de nombreux nouveaux membres (en cours de caractérisation). En microscopie électronique, leurs virions révèlent une même ultrastructure complexe : un compartiment interne bordé par une membrane elle-même entourée par un tégument épais de 70 nm constitué de trois couches : 20 nm d’une couche interne peu dense aux électrons, 25 nm d’un maillage de fibrilles parallèles à la surface dense aux électrons, et 25 nm d’une couche de matériaux de densité intermédiaire. Un pore apical est visible à une extrémité de chaque particule dont l’ouverture permet d’en délivrer le contenu dans le cytoplasme de l’hôte, à travers un canal formé par la fusion de la membrane interne du virion avec celle de la vacuole de l’amibe. En contraste avec les Mimiviridae, les Pandoravirions ne montrent pas de région centrale dense aux électrons correspondant habituellement au matériel génétique. Paradoxalement, la localisation et la structure physique de l’énorme génome caractérisant les Pandoravirus reste pour l’instant mystérieuse.

Notre choix du nom de « Pandoravirus », s’inspirait bien entendu de la mythologie grecque, selon laquelle la « boîte » (en fait une grande amphore appelée Pithos) reçue de Zeus par Pandore recelait un contenu mystérieux dont la révélation ne pouvait qu’avoir des conséquences désastreuses. Or, s’ils ne représentent aucun danger pour l’homme, puisqu’ils n’infectent que les amibes du genre Acanthamoeba, les Pandoravirus se sont révélés être dotés de propriétés s’avérant dévastatrices pour beaucoup des idées reçues concernant les virus. Pandoravirus salinus est, par exemple, doté d’un génome ADN de 2,8 millions de paires de bases ayant la capacité de coder plus de 2 500 protéines dont plus de 90 % n’ont aucune similarité de séquence avec des protéines (virales ou cellulaires) déjà répertoriées dans les bases de données. Paradoxalement, malgré un génome dont la taille est comparable à celle des plus petits microorganismes eucaryotes (les microsporidies) et trois fois plus grands que celui des mycoplasmes, les Pandoravirus sont tributaires du noyau de leur hôte pour leur réplication, contrairement aux Mimiviridae dont le cycle infectieux se déroule intégralement dans le cytoplasme. La synthèse des particules de Pandoravirus s’effectue par un mécanisme totalement original où le tégument complexe qui délimite les virions semble être synthétisé en même temps que leur contenu (comme si on fabriquait une bouteille en même temps qu’on la remplissait !). La synthèse de ces virions en forme d’amphore est initiée à partir de l’extrémité (l’apex) dont l’ouverture sert au déversement du contenu de la particule dans le cytoplasme lors de l’initiation de l’infection.

La découverte des Pandoravirus, qui ne présentent pas de parenté avec les Mimiviridae, a immédiatement suggéré que la diversité des virus géants infectant le même hôte amibien pouvait être plus importante que ce qu’avait laissé supposer l’isolement répétitif des premiers Mimiviridae. La forme en amphore des particules de Pandoravirus suggérait également que les virus géants n’étaient pas limités à des morphologies icosaédriques, ouvrant la possibilité que d’autres familles virales associées à des virions sans symétrie particulière aient pu être confondues avec des bactéries parasites comme ce fut d’ailleurs le cas pour Pandoravirus [21]. L’échantillonnage pouvait donc reprendre de plus belle.

En 2012, un article décrivant la régénération d’une plante (Silene stenophylla) à partir de fruits conservés dans une couche de permafrost (ou pergélisol) sibérien datée de 30 000 ans, a attiré notre attention [22]. Ce résultat spectaculaire provenait du laboratoire du Professeur Gilichinsky (malheureusement décédé peu après), un des pionniers de l’étude de la microbiologie des sols arctiques qui a consacré beaucoup d’efforts à démontrer que des organismes unicellulaires (bactéries, archaebactéries, protozoaires) pouvaient persister et survivre durant de très longues périodes dans les sols gelés [23]. En raison de l’absence de lumière et d’oxygène, de son pH neutre, de son environnement réducteur, le pergélisol du nord-est de la Sibérie est, a priori, un des plus appropriés à la survie des microorganismes. Nous avons donc initié une collaboration avec ce laboratoire pour explorer la possibilité que des virus infectant Acanthamoeba (présent dans le pergélisol) puissent également avoir survécu dans des strates de pergélisol d’ancienneté croissante, en commençant par celle datée de 30 000 ans.

Notre protocole habituel de co-culture de quelques grammes d’échantillons de pergélisol avec Acanthamoeba castellanii a rapidement révélé une mortalité des cellules accompagnée de la multiplication de particules d’une forme comparable à celle des virions de Pandoravirus, quoique légèrement plus allongées (1,5 µm contre 1 µm). Cependant, une analyse de coupes fines en microscopie électronique a montré que ces particules avaient une ultrastructure différente. Elles apparaissent constituées d’une enveloppe épaisse de 60 nm composée de bandes parallèles mais perpendiculaires à la surface. Cette enveloppe entoure une membrane lipidique qui délimite un compartiment interne dont la seule structure discernable est une petite sphère d’environ 50 nm de diamètre très dense aux électrons (parfois également visible dans les Pandoravirus). Chaque virion possède une ouverture à l’une de ses extrémités mais qui apparaît scellée par un « bouchon » (de 160 nm de diamètre et 80 nm d’épaisseur) constitué d’une grille de symétrie hexagonale.

Associée à l’absence de réplication par division, la détermination de la séquence complète du génome et de son contenu en gènes nous a permis de conclure à la nature véritablement virale de ce microorganisme préhistorique que nous avons baptisé Pithovirus sibericum en référence à sa forme en amphore et à son origine [6]. Son génome d’ADN double brin est circulaire (ou circulairement permuté), riche en AT (64 %) comme celui des Mimiviridae, mais ne compte que 610 033 paires de bases, une taille bien modeste comparée à celle de la particule (la plus volumineuse connue à ce jour). Paradoxalement, bien que ne codant que 467 protéines, Pithovirus semble disposer de la totalité des fonctions nécessaires à sa réplication sans faire appel au noyau de son hôte, au contraire des Pandoravirus. Néanmoins, comme attendu d’un virus, le génome de Pithovirus ne révèle aucune trace d’une machinerie de traduction (ribosome, ARNt [ARN de transfert] ligases, ARN ribosomaux). Pithovirus sibéricum inaugure donc une nouvelle famille de virus géant (les « Pithoviridae ») à la réplication intégralement cytoplasmique, mais sans la moindre parenté phylogénétique avec les Mimiviridae. Comme il est habituel pour tous les virus géants inaugurant une nouvelle famille, plus de deux tiers de ses protéines n’ont aucune similarité significative dans les bases de données [24]. Récemment, nos collègues marseillais ont décrit un cousin moderne de Pithovirus sibericum qu’ils ont baptisé Pithovirus massiliensis (leurs génomes sont identiques à 84 % en moyenne) [25]. La nouvelle famille des Pithoviridae est donc appelée à s’enrichir de nouveaux membres dans les années qui viennent.

Les premières phases de co-culture de l’échantillon duquel nous avions isolé Pithovirus sibericum, semblaient indiquer l’amplification progressive non pas d’un seul, mais de deux types de particules distinctes. Une fois réalisée la caractérisation de Pithovirus, des dilutions sériées de cette co-culture nous ont permis d’isoler un autre microorganisme mystérieux, d’une forme approximativement sphérique et d’un diamètre de 500 à 600 nm. En l’absence d’image de division binaire, la présence d’un deuxième virus géant a donc été suspectée puis validée par des observations en microscopie électronique et par le séquençage de l’ADN extrait de ces particules purifiées [7].

Examinées en coupes minces, ces particules apparaissent entourées par deux à quatre anneaux espacés de 25 nm correspondant à des fibres de différentes longueurs. Ces fibres sont ancrées dans un tégument constitué d’au moins deux couches de différentes densités et structures. La couche externe (épaisse de 10 nm) semble être formée de bandes tangentes à la surface de la particule et espacées de 30 à 40 nm. La couche interne (épaisse de 12 à 14 nm) est constituée d’un maillage de fibrilles qui ressemble à la couche centrale du tégument observé chez les Pandoravirus.

Le séquençage de l’ADN extrait des particules a révélé un génome linéaire de 651 523 paires de bases, riche en GC (60 %), codant 523 protéines dont aucune ne suggère la présence d’une machinerie de traduction. Il s’agit donc d’un virus géant que nous avons baptisé Mollivirus sibericum en référence à son origine, et aux formes « molles » que ces particules semblent adopter lors de leur passage dans les phagosomes au cours de la phase précoce d’infection des cellules d’Acanthamoeba. Si, comme à chaque comparaison d’un virus inaugurant une nouvelle famille, près des deux tiers des protéines prédites (et validées par l’analyse du transcriptome) ne ressemblent à rien de connu, Mollivirus sibericum montre une parenté phylogénétique partielle avec les Pandoravirus avec lesquels il partage 83 protéines homologues [7].

L’analyse en microscopie du cycle infectieux de Mollivirus sibericum dans Acanthamoeba castellanii met en évidence une déformation et une désorganisation du noyau de l’hôte qui sont suivies d’une synthèse de nouvelles particules à sa périphérie. La pénétration de l’ADN viral dans le noyau de l’amibe a pu être directement visualisée (grâce à un marquage avec de la 5-éthynyl-2′-déoxyuridine). Mollivirus sibericum est donc un virus dont la phase précoce de réplication est clairement nucléaire. Contrairement aux autres familles de virus géants que nous avons décrites, les nouvelles particules produites ne sont pas libérées simultanément par la lyse des cellules infectées, mais par un processus qui préserve plus longtemps l’intégrité de la cellule hôte et au cours duquel la plupart des particules sont libérées par exocytose [7].

Si la découverte des virus géants a brutalement et spectaculairement élargi le champ de la virologie, elle a aussi ressuscité des interrogations biologiques beaucoup plus fondamentales en ce qui concerne le statut même des virus : sur le fait qu’ils soient vivants ou non, sur leur origine, leur mode d’évolution, et leur relation avec le monde cellulaire [3, 26–28]. Dans cette dernière partie, nous décrirons brièvement les questions les plus ouvertes qui sont aujourd’hui sujettes à débat.

D’où viennent les virus géants ?

En l’absence de fossiles, la phylogénie moléculaire (i.e. la construction d’arbres à partir des séquences de protéines ou de leurs structures [30]) est le seul outil de la biologie moderne pour tenter de remonter le temps. Cette limitation est encore plus problématique pour des virus dont l’évolution serait, ou non, corrélée à celle de l’hôte qu’ils infectent : soit les virus accompagnent l’histoire de leur hôte, soit ils en changent ! Il est nécessaire, de plus, de disposer de nombreuses « espèces » de virus d’une même famille, mais infectant un éventail d’hôtes différents, pour éventuellement reconstituer leur histoire. À l’heure actuelle, seule la famille des Mimiviridae est assez diverse et nombreuse pour satisfaire ces critères. Finalement, cette reconstitution ne pourra être réalisée que sur la base des quelques gènes qui sont communs à ces virus et au reste de l’arbre du vivant (comme l’ADN polymérase). Le résultat est alors sans appel. Il est en accord avec la diversité des hôtes actuels : l’ancêtre des Mimividae était contemporain de l’origine même des eucaryotes. Quand on étend ce type d’analyse aux autres familles de virus géants (Pithovirus, Pandoravirus, Mollivirus), autant de branches différentes, dont l’origine se situe en amont de la radiation des Mimiviridae, sont générées (Figure 3). Tous les virus géants d’amibes ont donc une origine qui semble précéder celle des premières cellules à noyau… Mais quelle était la nature de cet ancêtre ?

Figure 3. Classification des grandes familles de virus à ADN. Phylogénie moléculaire (neighbor-joining) basée sur un alignement multiple des ADN polymérases. Chaque famille de virus géants semble émerger d’une lignée très ancienne, contemporaine ou précédant la radiation du règne eucaryote (en mauve) (d’après [24]).

Figure 3. Classification des grandes familles de virus à ADN. Phylogénie moléculaire (neighbor-joining) basée sur un alignement multiple des ADN polymérases. Chaque famille de virus géants semble émerger d’une lignée très ancienne, contemporaine ou précédant la radiation du règne eucaryote (en mauve) (d’après [24]).

Figure 4. Phylogénie et scénario d’acquisition du gène mutS par les Mimiviridae et son transfert aux octocoralliaires. Arbre calculé sur 752 sites selon l’algorithme neighbor-joining (modèle WAG, Whelan and Goldman).

Figure 4. Phylogénie et scénario d’acquisition du gène mutS par les Mimiviridae et son transfert aux octocoralliaires. Arbre calculé sur 752 sites selon l’algorithme neighbor-joining (modèle WAG, Whelan and Goldman).

Les auteurs déclarent n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article.