Vignette (Photo © IMBE BSHE - Thierry Orsiere).

Les champs d’application de la détection de mutations induites par l’environnement sont aussi larges que la démonstration d’innocuité en toxicologie réglementaire, le diagnostic clinique ou l’étude de la susceptibilité individuelle à des expositions génotoxiques environnementales ou anthropiques¹. Les tests actuels permettant de mesurer les effets de ces expositions sont souvent fastidieux à mettre en œuvre et coûteux. Les délais pour obtenir les résultats sont généralement de plusieurs jours et aucun ne permet encore la détection in vivo de mutations géniques chez l’homme. Pourtant, la mise au point d’un test simple, fiable, reproductible et rémanent capable de détecter un large spectre d’expositions génotoxiques est un réel enjeu pour la recherche en oncologie et en toxicologie réglementaire et environnementale.

Le gène PIG-A (PIG-A chez l’homme et le primate, Pig-a chez le rongeur) est impliqué dans la première étape de la biosynthèse de l’ancre glycosyl-phosphatidyl-inositol (GPI) [1] (voir Figure 1 p. 436). Il s’agit d’un gène sentinelle, hautement conservé entre les espèces [2], dont la fréquence de mutation est le reflet de celle des mutations somatiques acquises [3]. À ce titre, il a récemment fait l’objet de nombreuses recherches ayant permis le développement du « test PIG-A » qui estime la fréquence des cellules mutées pour le gène PIG-A par la mesure de la fréquence des cellules circulantes déficientes en ancre GPI [2, 4]. Le caractère innovant de cette approche réside dans la possibilité de mesurer ex vivo, au niveau du sang périphérique, une fréquence de cellules mutées sans avoir recours à une étape préalable de culture cellulaire.

Figure 1. Biosynthèse de l’ancre glycosyl-phosphatidyl-inositol (GPI) et gènes impliqués (d’après [1]).

Figure 1. Biosynthèse de l’ancre glycosyl-phosphatidyl-inositol (GPI) et gènes impliqués (d’après [1]).

Cette revue présente les divers aspects conceptuels et techniques ainsi que les perspectives d’utilisations du test PIG-A en recherche fondamentale et en recherche clinique.

L’ancre GPI est un complexe glycolipidique d’ancrage membranaire qui permet l’expression de nombreuses protéines au niveau de la membrane plasmique de la cellule. Le gène PIG-A code une sous-unité enzymatique impliquée dans la première étape de la synthèse de l’ancre GPI, l’obtention d’une ancre fonctionnelle nécessitant l’expression de 21 autres gènes [1]. Parmi ces différents gènes, PIG-A est le seul qui soit situé sur le chromosome X. Il se trouve à l’état hémizygote chez tous les sujets, y compris féminins, grâce au phénomène d’inactivation du chromosome X [5–7] (→).

(→) Voir la Nouvelle de S. Augui et E. Heard, m/s n° 6-7, juin-juillet 2008, page 584, et la Dernière Heure de C. Vallot et C. Rougeulle, m/s n° 2, février 2013, page 223

En conséquence, une seule mutation rendant le gène inactif entraîne dans la cellule l’arrêt de la production de l’ancre GPI dont la traduction phénotypique est la disparition des protéines membranaires ancrées par le GPI. Parmi ces protéines figurent de multiples clusters de différenciation (CD) tantôt spécifiques de la cellule qui les porte, comme le CD66b qui est exprimé par les granulocytes, tantôt non spécifiques comme des protéines régulatrices du complément qui sont ubiquitaires telles que le CD55 (decay accelerating factor - DAF) ou le CD59 (membrane inhibitor of reactive lysis – MIRL) [8]. Dans ce dernier cas, l’absence de ces protéines à la surface des cellules circulantes les rend sensibles à l’attaque du complément et constitue le point clé de la physiopathologie d’une maladie hématologique, l’hémoglobinurie paroxystique nocturne (HPN) [9]. Il s’agit d’une anémie hémolytique rare (prévalence : 1 à 10/1 000 000) dans laquelle, en raison d’une mutation acquise du gène PIG-A, la moelle osseuse produit de manière clonale des cellules hématopoïétiques déficientes en GPI et par conséquent en CD55 et CD59 [9]. L’absence de ces protéines de surface est responsable d’une hémolyse intravasculaire relayée par le complément à l’origine des manifestations cliniques : anémie, thromboses, insuffisance rénale chronique ou dystonie musculaire lisse [9].

Les mutations du gène PIG-A, situé sur le chromosome X, sont les seules pouvant statistiquement aboutir au phénotype de déficience en ancrage GPI. En effet, tous les autres gènes impliqués dans la synthèse du GPI sont autosomiques. Deux mutations inactivant les deux allèles du même gène seraient donc nécessaires pour produire une déficience avec une fréquence théorique évaluée à 2 x 10^-14, soit dix millions de fois plus faible que celle estimée pour des mutations spontanées du gène PIG-A [10].

L’International Workgroup on Genotoxicity Testing (IWGT) admet aujourd’hui la réciprocité entre une cellule mutée sur le gène PIG-A et une cellule déficiente en ancre GPI grâce à l’établissement de deux relations réciproques [11]. D’une part, les recherches sur l’HPN ont montré que le phénotype GPI-déficient était lié à une mutation de PIG-A et que la transfection d’un gène PIG-A sauvage dans une cellule de phénotype HPN restaurait la présence de l’ancre GPI et des protéines GPI-ancrées à la surface de la cellule [5]. D’autre part, chez l’animal, après exposition génotoxique contrôlée, le séquençage du gène Pig-a a identifié des mutations acquises uniquement dans les cellules GPI-déficientes [12–14]. L’ensemble de ces résultats permet d’affirmer que la mutation du gène PIG-A est responsable d’un phénotype GPI-déficient et, réciproquement, qu’une cellule GPI-déficiente est porteuse d’une mutation touchant le locus PIG-A.

De très faibles fréquences de populations de granulocytes et d’érythrocytes circulants GPI-déficients ont été découvertes chez les sujets sains (entre 10 et 50 cellules déficientes pour 10⁶ cellules totales) [4, 15]. Le séquençage du gène PIG-A dans les cellules circulantes GPI-déficientes a identifié, chez un même donneur sain, des mutations qui se sont révélées différentes au cours du temps, alors même que la fréquence des cellules GPI-déficientes dans le sang circulant restait identique [4]. Ceci, ne pouvant être expliqué que par l’acquisition de mutations de novo par les précurseurs hématopoïétiques à mesure que d’autres disparaissent, a conduit à proposer la fréquence des mutations du gène PIG-A, estimée par la mesure de la fréquence des cellules GPI-déficientes, comme un marqueur de mutations somatiques acquises. La fréquence spontanée des cellules GPI-déficientes mesurée (entre 10 et 30 x 10^-6) est comparable à celle observée avec les tests fondés sur l’analyse des gènes codant l’hypoxanthine phosphoribosyltransférase (hprt), la glycophorine A ou le HLA-A (human leucocyte antigen A) (entre 0,5 et 30 x 10^-6) qui sont utilisés pour estimer la fréquence des mutations somatiques spontanées [16].

Le test PIG-A consiste à réaliser un immunomarquage à l’aide d’anticorps fluorescents spécifiques de protéines ancrées par le GPI ou de ligand dirigé vers le GPI lui-même, suivi de la quantification par cytométrie en flux de la fréquence des cellules déficientes en ancre GPI présentes dans l’échantillon, reflet de la fréquence des mutations qui entraînent l’inactivation du locus PIG-A. Les cellules ne présentant pas de fluorescence sont indifféremment appelées « cellules GPI-déficientes », « mutants » ou parfois « cellules PIG-A mutées ». Cette technique permet l’analyse automatisée et à haut débit de plusieurs millions de cellules selon des spécifications techniques (paramétrage du cytomètre en flux, populations cellulaires d’intérêt, choix des couples anticorps-fluorochromes) ayant fait l’objet de recommandations [17]. La technique est inspirée du diagnostic et du suivi de patients HPN chez lesquels le nombre de cellules GPI-déficientes peut représenter jusqu’à plus de 98 % des cellules circulantes, soit plusieurs dizaines de millions de mutants par millilitre de sang total [18]. En conséquence, l’analyse d’un grand nombre d’événements (au moins un million de cellules d’intérêt) est nécessaire pour atteindre la sensibilité optimale pour une détermination fiable de la fréquence des mutants, ce qui rend la technique extrêmement sensible à la présence de faux négatifs² [19]. De ce fait, les choix des populations cellulaires analysées, des anticorps utilisés et des paramètres du cytomètre sont des points critiques dans la mise au point du test PIG-A.

Le test PIG-A a été particulièrement développé dans le domaine de la mutagenèse environnementale et réglementaire. Son intérêt réside, en partie, dans les faibles volumes de sang nécessaires pour l’examen permettant ainsi des analyses itératives, par exemple sur le même animal dans les études de toxicologie à administrations réitérées. Les protocoles appliqués actuellement chez le rongeur permettent d’analyser en quelques minutes plus d’un million d’érythrocytes ou de réticulocytes à partir d’un prélèvement sanguin de 100 µl [27]. Si le principe du test reste inchangé, le protocole a progressivement été amélioré afin d’augmenter ses performances tout en limitant le nombre d’événements totaux analysés. Ces avancées reposent sur un enrichissement de l’échantillon en une population cellulaire s’avérant minoritaire afin d’augmenter la proportion de cellules d’intérêt dans l’échantillon analysé. L’enrichissement magnétique permet ainsi d’augmenter la proportion de cellules d’intérêt selon des critères phénotypiques. Il consiste à marquer la population cellulaire ciblée avec un anticorps spécifique fixé sur des billes magnétiques. Un champ magnétique permettra de retenir les cellules marquées fixées sur les billes. L’analyse sera réalisée soit sur les cellules retenues [4, 30], soit sur les cellules non marquées, et donc libres, qui seront récupérées dans l’éluat [27].

Les caractéristiques du gène PIG-A en font un marqueur fidèle de l’impact mutagène d’agents chimiques ou de contaminants de l’environnement : sa localisation sur le génome en fait un gène sentinelle reconnu pour la mesure de la fréquence des mutations somatiques in vivo [3] et sa sensibilité à des modes d’actions génotoxiques très divers est démontrée [33]. Le séquençage du gène PIG-A réalisé sur des cellules issues de patients HPN et de sujets sains a ainsi identifié plus de 100 mutations inactivantes (parmi lesquelles des mutations non-sens, faux-sens, des décalages du cadre de lecture, des substitutions, et de larges délétions) aboutissant toutes au même phénotype de déficience en GPI, suggérant que le gène PIG-A puisse être sensible à un grand nombre de modes d’actions génotoxiques [15, 34]. Deux lacunes identifiées par l’IWGT en 2015 ont été comblées par la publication de deux études récentes : les performances du test ne dépendent en fait pas du nombre de copies du chromosome X portées par l’individu, les fréquences spontanées et induites de cellules mutées pour le gène PIG-A n’étant pas différentes entre mâles et femelles [23, 35, 36] ; l’érythropoïèse compensatoire observée après exposition à un agent hémolysant non génotoxique (comme le 2-butoxyéthanol) n’entraîne pas d’augmentation de la fréquence des cellules GPI-déficientes [37].

Ces qualités ont initié l’évaluation du test PIG-A in vitro : le séquençage du gène PIG-A réalisé sur des lymphoblastes humains cultivés in vitro et soumis à divers génotoxiques connus, a révélé des résultats comparables à ceux obtenus in vivo chez la souris après exposition aux mêmes agents [38]. PIG-A est également un bon marqueur d’instabilité génomique in vitro : la fréquence de cellules GPI-déficientes est en effet augmentée dans des lignées de cellules cancéreuses coliques et le séquençage de PIG-A dans ces cellules a mis en évidence 7 types de mutations [39]. Chez l’animal, le séquençage du gène Pig-a a révélé la survenue de mutations induites spécifiques du mode d’action du mutagène utilisé [12–14].

La sensibilité et la spécificité du test PIG-A évaluées dans diverses études, incluant les principaux mutagènes connus et des agents non-mutagènes, selon divers schémas d’administration, ont accru son intérêt en toxicologie réglementaire à tel point que l’IWGT (International workshop on genotoxicity testing) a proposé sa réalisation en complément du micronoyau^7, au cours des tests réglementaires [11].

Le test PIG-A ne permettrait cependant pas de détecter l’impact potentiel, en termes de mutations géniques, d’expositions brèves et accidentelles, dans les heures ou jours qui suivent l’exposition. En effet, pour que ce biomarqueur puisse retranscrire la mutagénicité de l’exposition, celle-ci doit être suivie du délai nécessaire à l’expression phénotypique des mutants, qui intègrent ici le renouvellement de la population cellulaire d’intérêt. Le test PIG-A serait donc a priori plus adapté au suivi des expositions chroniques et éventuellement multiples à de faibles niveaux de doses, telles que l’on peut en rencontrer en milieu professionnel. Ce test n’est réalisable que sur des cellules circulantes. Adapté aux effets systémiques, il ne sera donc pas informatif dans le cas d’une génotoxicité limitée à un organe spécifique.

Le phénotype GPI-déficient est associé, chez l’homme, à une grande diversité de variations de séquence du gène PIG-A. Chez l’animal, il est relié à l’effet d’expositions génotoxiques de modes d’actions très divers. Ces deux informations nous permettent de supposer que l’identification de cellules GPI-déficientes est susceptible de révéler certaines expositions de l’homme à des agents génotoxiques présentant des modes d’action mutagène variés. La quantification de la fréquence de mutation du gène PIG-A pourrait ainsi apporter des informations utiles si elle s’inscrit dans le cadre du suivi d’enquêtes épidémiologiques de populations professionnellement exposées à des mutagènes, dans le suivi de volontaires sains ou de patients lors d’essais cliniques afin de comparer les fréquences obtenues à celles acquises dans des modèles expérimentaux différents lors des phases de développement précliniques.

Enfin, la possibilité de réaliser le test ex vivo permet une évaluation rapide, globale et intégrée de la sensibilité de l’individu à un environnement génotoxique, tenant compte de la variabilité interindividuelle induite par les polymorphismes génétiques, notamment concernant les gènes impliqués dans la réparation de l’ADN et/ou dans le métabolisme des xénobiotiques. Après expression phénotypique des conséquences d’une exposition mutagène et renouvellement de la population de cellules analysées postérieurement à l’exposition que l’on veut renseigner, le test PIG-A permet, en estimant la fréquence des cellules circulantes mutées pour le gène PIG-A, de disposer des résultats d’un biomarqueur d’effet moins de 2 h après la réalisation du prélèvement sanguin.

Les auteurs déclarent n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article.