Vignette (Photo © Alessandro Furlan).

En fonction des conditions rencontrées dans son microenvironnement, la cellule adapte ses programmes transcriptionnels pour assurer son intégrité et celle de l’organisme. Les mécanismes les plus fréquemment décrits pour réguler la transcription font intervenir la fixation de combinaisons de facteurs de transcription spécifiques sur les promoteurs des gènes concernés. Les cellules ont cependant mis en place de nombreux autres niveaux de régulation. Parmi ceux-ci figurent notamment les séquences régulatrices de type enhancers, les mécanismes d’épissage intervenant en parallèle de l’élongation des transcrits, ou encore les modifications épigénétiques affectant l’état de la chromatine. Dans les cellules eucaryotes, l’initiation de la transcription est suivie d’une mise en pause, une cinquantaine de nucléotides en aval du site d’initiation, pour environ 60 % des gènes [1]. Cette revue se focalise sur l’intérêt thérapeutique potentiel des acteurs moléculaires impliqués dans la levée de cette pause.

L’ARN polymérase II (ARN pol II), responsable de la transcription des ARN messagers (ARNm) des cellules eucaryotes, est un complexe supramoléculaire constitué de 12 sous-unités dont la masse moléculaire globale dépasse les 500 kDa. La sous-unité porteuse de l’activité polymérase, Rpb1, est une protéine d’environ 250 kDa qui possède à son extrémité C-terminale (CTD pour C-terminal domain) une répétition de 52 hexapeptides YSPTSPS¹ cruciaux pour la régulation de l’élongation de la transcription [2]. La polymérase s’arrête en effet généralement de transcrire une cinquantaine de nucléotides en aval du site d’initiation de la transcription, sous l’effet des facteurs associés DSIF (DRB sensitivity inducing factor) et NELF (negative elongation factor). Ce complexe de pause est désactivé par la phosphorylation au niveau des sérines en position 2 (Ser2) du CTD de la polymérase et des protéines DSIF et NELF.

Le complexe P-TEFb (positive transcription elongation factor b) est porteur de l’activité kinase capable d'achever cette pause [3]. P-TEFb est un dimère constitué de la kinase cdk9 (cyclin-dependent kinase 9) et de la cycline T1 (ou T2, plus rarement). La cycline T1 (CT1) module l’activité de cdk9 et joue un rôle d’intégrateur des signaux cellulaires. Elle possède ainsi différents domaines d’interactions avec diverses protéines, dont l’ARN pol II, HEXIM1 (hexamethylene bisacetamide inducible 1), mais aussi l’ARN non codant 7SK (Figure 1) (pour une revue, voir [4]).

Figure 1. Les principaux acteurs connus des mécanismes de levée de pause transcriptionnelle. L’activité de l’ARN polymérase II (Pol II) est précédée par la formation du PIC (pre-initiation complex) au niveau du promoteur du gène. Le PIC est composé des facteurs généraux de transcription, TFII A, B, D, E et H, interagissant avec le complexe Mediator et Pol II. TFII H phosphoryle le CTD (C-terminal domain) de Pol II sur les résidus Ser5 et permet l’initiation de la transcription. Pol II entre ensuite en pause, une cinquantaine de nucléotides en aval du site d’initiation de la transcription pour la majorité des gènes, sous l’action notamment des facteurs négatifs d’élongation DSIF (DRB sensitivity inducing factor) et NELF (negative elongation factor). La levée de pause est assurée principalement par P-TEFb (positive transcription elongation factor), qui va phosphoryler (« P » encerclés sur la figure) la Ser2 du CTD, ainsi que DSIF et NELF. DSIF reste associé à la polymérase et se transforme en facteur positif d’élongation, tandis que NELF se dissocie de la polymérase qui commence l’élongation productive. P-TEFb existe sous forme libre ou sous une forme inactive complexée avec HEXIM (hexamethylene bisacetamide inducible 1) et l’ARN 7SK entre autres au sein de la ribonucléoprotéine 7SK (RNP 7SK). P-TEFb peut être recruté de différentes manières aux sites de transcription. Pour des soucis de clarté du schéma, nous avons représenté côte à côte deux modes de recrutement, bien que ceux-ci ne soient pas les seuls possibles et non exclusifs. La protéine Brd4 (bromodomain-containing protein 4), qui se fixe au niveau des histones acétylées (forme ovale notée « H », avec « Ac » encerclé sur la figure) peut notamment induire la dissociation de P-TEFb d’HEXIM et 7SK et permettre son recrutement. Le complexe Mediator et PAF1 (polymerase-associated factor 1) participent aussi au recrutement de P-TEFb, associés au complexe multimérique SEC (super elongation complex). En parallèle, P-TEFb peut également être recruté au niveau des promoteurs sous sa forme complexée avec la RNP 7SK, via l’interaction de cette dernière avec KAP1 (KRAB-interacting protein 1). La dégradation de l’ARN 7SK permet alors la libération in situ de P-TEFb actif.

Figure 1. Les principaux acteurs connus des mécanismes de levée de pause transcriptionnelle. L’activité de l’ARN polymérase II (Pol II) est précédée par la formation du PIC (pre-initiation complex) au niveau du promoteur du gène. Le PIC est composé des facteurs généraux de transcription, TFII A, B, D, E et H, interagissant avec le complexe Mediator et Pol II. TFII H phosphoryle le CTD (C-terminal domain) de Pol II sur les résidus Ser5 et permet l’initiation de la transcription. Pol II entre ensuite en pause, une cinquantaine de nucléotides en aval du site d’initiation de la transcription pour la majorité des gènes, sous l’action notamment des facteurs négatifs d’élongation DSIF (DRB sensitivity inducing factor) et NELF (negative elongation factor). La levée de pause est assurée principalement par P-TEFb (positive transcription elongation factor), qui va phosphoryler (« P » encerclés sur la figure) la Ser2 du CTD, ainsi que DSIF et NELF. DSIF reste associé à la polymérase et se transforme en facteur positif d’élongation, tandis que NELF se dissocie de la polymérase qui commence l’élongation productive. P-TEFb existe sous forme libre ou sous une forme inactive complexée avec HEXIM (hexamethylene bisacetamide inducible 1) et l’ARN 7SK entre autres au sein de la ribonucléoprotéine 7SK (RNP 7SK). P-TEFb peut être recruté de différentes manières aux sites de transcription. Pour des soucis de clarté du schéma, nous avons représenté côte à côte deux modes de recrutement, bien que ceux-ci ne soient pas les seuls possibles et non exclusifs. La protéine Brd4 (bromodomain-containing protein 4), qui se fixe au niveau des histones acétylées (forme ovale notée « H », avec « Ac » encerclé sur la figure) peut notamment induire la dissociation de P-TEFb d’HEXIM et 7SK et permettre son recrutement. Le complexe Mediator et PAF1 (polymerase-associated factor 1) participent aussi au recrutement de P-TEFb, associés au complexe multimérique SEC (super elongation complex). En parallèle, P-TEFb peut également être recruté au niveau des promoteurs sous sa forme complexée avec la RNP 7SK, via l’interaction de cette dernière avec KAP1 (KRAB-interacting protein 1). La dégradation de l’ARN 7SK permet alors la libération in situ de P-TEFb actif.

P-TEFb peut se complexer avec l’ARN 7SK et les protéines HEXIM1, LARP7 (La-related protein 7) et MePCE (methyl capping enzyme), qui constituent la ribonucléoprotéine (RNP) 7SK (pour revue, voir [5]) (→).

(→) Voir la Synthèse de L. Muniz et al., m/s n° 2, février 2012, page 200

L’activité kinasique de P-TEFb est inhibée au sein de ce complexe [6,7]. Un équilibre se forme dans les cellules, entre les formes libres de P-TEFb et celles associées à la RNP 7SK. Plusieurs protéines sont capables de dissocier P-TEFb de ce super-complexe, particulièrement en conditions de stress, et ainsi de favoriser la levée de pause et l’élongation transcriptionnelle. P-TEFb peut, notamment, être libéré par différents signaux de transduction dont Akt (protéine kinase B) et ERK (extracellular signal-regulated kinase) (pour revue, voir [8]).

Nous proposons dans la Figure 1, une synthèse des acteurs majeurs impliqués dans la levée de pause transcriptionnelle au regard des dernières avancées sur le sujet.

La protéine Brd4 (bromodomain-containing protein 4) appartient à la famille de protéines BET (bromodomain and extraterminal domain) qui reconnaissent les histones acétylées. Les premiers travaux sur Brd4 et la levée de pause suggéraient le recrutement de P-TEFb sur les promoteurs sous sa forme active, non associée à la ribonucléoprotéine 7SK [9]. Des travaux récents mettent cependant en évidence au niveau des promoteurs un ancrage de la RNP 7SK via KAP1 (KRAB interacting protein 1) qui favorise ainsi le recrutement de P-TEFb [10]. CT1 possède un domaine d’interaction avec l’ARN pol II qui pourrait également participer au recrutement de P-TEFb. Nous avons toutefois montré, par des approches de microscopie de type FRET² en cellules vivantes, que la perte d’interaction entre P-TEFb et l’ARN pol II, suite à la mutation de ce domaine, ne perturbe pas la localisation de P-TEFb à proximité de la chromatine [11].

Au-delà du recrutement de P-TEFb, Brd4 peut aussi agir sur la levée de pause, en recrutant au niveau d’enhancers, la déméthylase JMJD6 (Jumonji C-domain-containing protein 6) qui élimine des marques de répression de la chromatine (méthylation symétrique de l’histone H4 sur le résidu argininine en position 3, H4R3me2s) et déstabilise l’ARN 7SK [12]. Brd4 possède également une activité HAT (histone acetyltransferase) [13]. Elle aurait, de surcroît, un rôle dans le contrôle des stress de torsion de l’ADN après la levée de pause [14]. Ainsi, Brd4 a été présenté comme un acteur clé de la levée de pause (Figure 2), pouvant même phosphoryler le CTD de la polymérase sur les résidus Ser2, en court-circuitant cdk9. Toutefois, Brd4 est une kinase atypique : elle ne possède pas de motif kinase consensus, mais plusieurs motifs similaires dispersés, et son activité de phosphorylation directe du CTD est controversée. De plus, l’existence d’un dialogue entre les kinases cdk7, cdk9 et Brd4 suggère qu’un réseau de rétrocontrôles module la phosphorylation du CTD de l’ARN pol II par ces kinases [15], ce qui va à l’encontre du concept de Brd4 agissant comme une kinase indépendante.

Figure 2. Brd4, une protéine aux fonctions multiples dans la transcription. Brd4 (bromodomain-containing protein 4) est une protéine ayant une activité pléiotropique possédant notamment des activités kinase et histone acétyltransférase (HAT). Via ses bromodomaines, Brd4 interagit avec les histones acétylées (Ac). Son activité HAT lui permet d’induire le décompactage de la chromatine et l’éviction des nucléosomes, nécessaires à la transcription. Cette activité HAT lui confère également un rôle dans le maintien des marquages épigénétiques lors de la mitose. Brd4 est une kinase atypique (l’activité kinase est portée par plusieurs motifs séparés dans la séquence primaire de la protéine) potentiellement capable de phosphoryler P-TEFb (positive transcription elongation factor) et le CTD (domaine C-terminal) de l’ARN polymérase II (« P » encerclé sur la figure) - cette activité reste sujette à controverse. Outre le recrutement de P-TEFb, Brd4 recrute la déméthylase JMJD6 (Jumonji C-domain-containing protein 6) au niveau d’enhancers appelés anti-pause enhancers, où JMJD6 retire des marques de répression de la transcription. Enfin Brd4 contribue à l’activation complète de la topoisomérase 1 pour ajuster les stress de torsion de l’ADN lors de l’élongation transcriptionnelle.

Figure 2. Brd4, une protéine aux fonctions multiples dans la transcription. Brd4 (bromodomain-containing protein 4) est une protéine ayant une activité pléiotropique possédant notamment des activités kinase et histone acétyltransférase (HAT). Via ses bromodomaines, Brd4 interagit avec les histones acétylées (Ac). Son activité HAT lui permet d’induire le décompactage de la chromatine et l’éviction des nucléosomes, nécessaires à la transcription. Cette activité HAT lui confère également un rôle dans le maintien des marquages épigénétiques lors de la mitose. Brd4 est une kinase atypique (l’activité kinase est portée par plusieurs motifs séparés dans la séquence primaire de la protéine) potentiellement capable de phosphoryler P-TEFb (positive transcription elongation factor) et le CTD (domaine C-terminal) de l’ARN polymérase II (« P » encerclé sur la figure) - cette activité reste sujette à controverse. Outre le recrutement de P-TEFb, Brd4 recrute la déméthylase JMJD6 (Jumonji C-domain-containing protein 6) au niveau d’enhancers appelés anti-pause enhancers, où JMJD6 retire des marques de répression de la transcription. Enfin Brd4 contribue à l’activation complète de la topoisomérase 1 pour ajuster les stress de torsion de l’ADN lors de l’élongation transcriptionnelle.

Le modèle d’un Brd4 multifonction agissant seul dans la levée de pause est aussi contredit par l’exemple des gènes hsp70 codant les protéines de choc thermique HSP70. Ces gènes sont classiquement en pause transcriptionnelle dans les cellules ; la levée de pause de ces gènes sera induite par un choc thermique. Il a récemment été montré que l’inhibition de Brd4 n’affecte pas l’induction des gènes hsp70 en réponse à un choc thermique, alors qu’elle bloque le remodelage de régions spécifiques de la chromatine réalisé par Brd4 [16]. Il existe probablement différents schémas de levée de pause selon les gènes, en lien notamment avec le niveau d’accessibilité des régions de la chromatine et des gènes transcrits.

Il est important de souligner que les différents modèles de levée de pause peuvent aussi avoir pour origine des approches expérimentales et des modèles cellulaires différents (drosophile, souris, humain). Le Tableau I récapitule les avantages et les biais des principales techniques employées pour étudier le mécanisme de levée de pause. Initialement, les approches de biochimie ont permis de définir les partenaires de P-TEFb. Elles sont maintenant complétées par les expériences de séquençage, qui permettent d’étudier la production d’ARN naissants, avec la position de régulateurs de la transcription ou de la polymérase sur les gènes. La microscopie de fluorescence permet quant à elle de localiser, dans des cellules analysées individuellement, la formation de complexes de levée de pause, ou de définir la façon dont ces complexes protéiques explorent l’ADN nucléaire pour trouver leurs séquences cibles [17]. Les approches de microscopie en cellules vivantes sont essentielles : elles donnent accès à la dimension dynamique qui est primordiale dans les mécanismes de levée de pause. Un des enjeux futurs sera de réussir à intégrer des données multiparamétriques (incluant les big data issues des séquençages à haut débit) en utilisant des outils de modélisation appropriés.

Les différents modèles de recrutement et d’activité de P-TEFb et Brd4 sur les promoteurs, parfois contradictoires, représentent donc probablement chacun une facette différente d’une même histoire (ou d’histoires proches) analysée(s) par différents outils.

Outre la possibilité de réaliser une ultime vérification avant que l’élongation transcriptionnelle ne soit engagée, le système de levée de pause présente une rapidité de réaction intéressante. En effet, l’existence de transcrits préchargés avec la polymérase permet une réactivité importante au niveau de la transcription. Cela peut s’avérer utile notamment en conditions de réponse et d’adaptation à un stress cellulaire. Cela permet également d’anticiper et de synchroniser l’activité de gènes régulés de manière périodique, comme suggéré au cours du cycle circadien [18]. La levée de pause confère ainsi, en un certain sens, un art de l’anticipation aux cellules.

Le mécanisme de levée de pause a également été étudié dans le cadre des reprises de transcription après la mitose [19]. Les protéines impliquées dans la levée de pause sont importantes pour le marquage épigénétique, au cours de la mitose, afin d’accélérer la reprise transcriptionnelle, comme cela a été montré pour Brd4 [20]. Ce marquage épigénétique permet aux cellules de conserver leur profil d’expression, et ainsi leur identité, lors des divisions cellulaires. Il est donc crucial au cours de l’embryogenèse pour assurer l’expression appropriée des gènes du développement dans une période où les divisions cellulaires s’enchaînent rapidement et où les cellules se différencient progressivement.

Il ne faut pas, non plus, oublier que P-TEFb module également le recrutement du spliceosome³ [53] (→) et d’autres étapes ultérieures de la transcription, comme la terminaison et l’export des ARNm (pour revue, voir [21]).

(→) Voir la Synthèse de G. Dujardin et al., m/s n° 12, décembre 2016, page 1103

Comme nous l’avons vu, la levée de la pause transcriptionnelle constitue un mécanisme impliquant la coordination précise de plusieurs partenaires. Des perturbations physiopathologiques peuvent survenir dans cette orchestration et provoquer différents dysfonctionnements. Il est important de noter ici que, bien que les acteurs impliqués possèdent des activités clairement associées à la levée de pause, ils interviennent aussi dans des activités connexes dans le processus de transcription. On ne peut donc exclure que ces activités connexes contribuent aux altérations physiologiques liées aux défauts d’expression ou d’activité de ces acteurs.

La levée de pause constitue un mécanisme de contrôle de la transcription permettant une réponse transcriptionnelle rapide et synchronisée. Différents modèles reposant sur des acteurs clés, P-TEFb et Brd4, ont été proposés, correspondant sans doute à différentes facettes d’une réalité dynamique. L’évolution d’outils a permis et permet de raffiner constamment les connaissances à ce sujet. Le développement du séquençage à haut débit sur cellules individuelles apporte ainsi une vision plus nette de la régulation au niveau de différents promoteurs. De même, l’amélioration des techniques de microscopie et de biophotonique nous permet d’obtenir de plus en plus d’informations quantitatives sur les complexes moléculaires qui participent au processus. Le développement d’approches biophysiques, pour analyser les dynamiques moléculaires, constitue un autre atout pour comprendre des agencements variés qui interviennent dans une même cellule vivante, et pour permettre une étude spatiale et dynamique de cette régulation transcriptionnelle. Un des défis qui reste à relever sera de réussir à croiser les données issues des approches multi-omics (épigénomique, transcriptomique, etc.) et celles de la microscopie autour d’une stratégie de recherche commune.

Les processus d’initiation, de levée de pause, d’élongation, d’épissage et de terminaison de la transcription sont intriqués et présentent des acteurs communs. Il est ainsi difficile d’attribuer, de manière simpliste, une action propre à chaque musicien sur la partition. Un défi futur sera donc d’adapter nos études afin d’examiner et comprendre ce véritable travail d’orchestre, plutôt que la somme des prestations de différents solistes. En ce sens, la biologie des systèmes peut être d’un grand intérêt pour appréhender de tels systèmes non linéaires, fondés sur des interactions croisées et des boucles de rétrocontrôle.

Enfin, la recherche translationnelle représente un enjeu majeur de la recherche autour du complexe de levée de pause. Les acteurs moléculaires qui y participent, constituent en effet des cibles prometteuses pour plusieurs pathologies. Toutefois, de par l’action ubiquitaire des molécules susceptibles d’être ciblées, notamment les protéines de la famille BET (qui sont impliquées dans la physiologie cardiaque, la tolérance immunitaire, le renouvellement intestinal, la spermatogenèse, la latence de virus, etc.), il sera important d’évaluer la toxicité et l’impact des agents thérapeutiques utilisés lors de traitements prolongés.

Les auteurs déclarent n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article.